Мобильная версия

Журнал «Боль. Суставы. Позвоночник» Том 12, №4, 2022

Вплив альфакальцидолу на регенерацію кістки у щурів старечого віку

Авторы: Климовицький Ф.В. (1), Климовицький В.Г. (1), Дєдух Н.В. (2)
(1) — Донецький національний медичний університет, м. Лиман, Україна
(2) — ДУ «Інститут геронтології імені Д.Ф. Чеботарьова НАМН України», м. Київ, Україна

Рубрики: Ревматология, Травматология и ортопедия

Разделы: Клинические исследования

Актуальність. Серед препаратів, які мають плейотропну дію на кісткову тканину, особливу увагу привертає альфакальцидол — попередник активної форми D-гормона. Існують дослідження, у яких виявлено відмінні особливості впливу альфакальцидолу на регенерацію кістки за умов остеопорозу та в молодих тварин. Мета дослідження: вивчити особливості регенерації кістки після лікування альфакальцидолом у тварин старечого віку. Матеріали та методи. Щурам віком 24 місяці у ділянці метадіафіза моделювали транскортикальний дефект від латерального до медіального відділу стегнової кістки. Лікування альфакальцидолом проводили з 2-ї доби та протягом 10-ї та 30-ї діб до виведення тварин з експерименту. Проведено гістологічне дослідження регенерації кістки з морфометричним аналізом тканин у ділянках мозолі. Результати. На 10-ту добу після лікування альфакальцидолом тварин старечого віку в ділянці дефекту розташовувалася сполучна тканина, остеоїд та грубоволокниста трабекулярна кістка з високою щільністю остеобластів. На 30-ту добу у тварин, які отримували лікування, кісткова тканина регенерату мала пластинчасту будову й була зрілою порівняно з тваринами без лікування. У ділянці губчастої кістки була розташована сітка новоутворених кісткових трабекул. Деструктивні прояви навколо дефекту знижувалися у тварин, які отримували альфакальцидол. У тварин без лікування не виявлено щільного кісткового зрощення з фрагментами кортекса, трабекули губчастої кістки були переривчасті. У латеральній частині регенерату площа кісткової тканини була зменшена. Висновки. Лікування тварин альфакальцидолом прискорює формування кісткової тканини в дефекті та зменшує деструктивні прояви навколо дефекту порівняно з тваринами, яких не лікували.

Background. Among the drugs that have a pleiotropic effect on bone, attention is drawn to alfacalcidol – the precursor of the active form of D-hormone. There are studies that have revealed distinctive features of the effect of alfacalcidol on bone regeneration in osteoporosis and in young animals. The purpose was to study bone regeneration after treatment with alfacalcidol in senile animals. Materials and methods. A transcortical defect from the lateral to the medial femur was modeled in rats aged 24 months in the area of the metadiaphysis. A treatment with alfacalcidol was carried out from the 2-nd day and for 10 and 30 days before the animals was withdrawn from the experiment. Histological study of bone regeneration with morphometric analysis of tissues in the areas of callus had been performed. Results. On the 10-th day of the treatment with alfacalcidol in senile animals, connective tissue, osteoid and coarse-fibrous trabecular bone with a high density of osteoblasts were located in the defect area. On the 30-th day in treated animals, the bone tissue of the callus was mature; its area was larger than in untreated animals. In the area of cancellous bone there is a network of newly formed bone trabeculae. Destructive manifestations around the defect were reduced in animals treated with alfacalcidol. In untreated animals there was no dense bone fusion with cortex fragments; trabeculae of cancellous bone were intermittent. In the lateral part of the callus, the area of bone tissue was reduced compared to the medial part. Conclusions. Treatment of animals with alfacalcidol accelerates the formation of bone tissue in the defect and reduces destructive manifestations around the defect compared to untreated animals.

Ключевые слова

старечі щури; кістка; регенерація; гістологія; альфакальцидол

senile rats; bone; regeneration; histology; alfacalcidol

doi: http://dx.doi.org/10.22141/pjs.12.4.2022.346

Вступ

Переломи в старості є серйозною проблемою як у клінічному аспекті, так і для системи охорони здоров’я в цілому. Одним із актуальних напрямків є дослідження регенерації з віком. Зі старінням процес регенерації кістки уповільнюється, що призводить до порушення зрощення відламків [1–3]. З віком знижується регенераторний потенціал кістки, збільшуються терміни перебування пацієнтів у стаціонарі, підвищується ризик захворюваності та смертності [2, 4].

На регенерацію впливають безліч факторів старіючого організму: знижується диференціювання клітин — попередників фібробластів і остеобластів, порушуються молекулярні механізми взаємодії факторів росту, підвищується баланс прозапальних цитокінів, у жінок знижується рівень естрогенів, які керують метаболізмом кісткової тканини [5–7]. Негативний вплив на репаративний остеогенез мають різні запальні захворювання і остеопороз [8, 9].

Для підвищення ефективності лікування переломів розробляються різні способи цілеспрямованого впливу на репаративний остеогенез із метою його оптимізації та стимуляції, що пов’язано з використанням факторів росту, стовбурових мезенхімальних клітин, авто- та алогенних трансплантатів, лікарських препаратів, серед яких активна форма альфакальцидолу (1-альфа-гідрохолекальциферол). Плейотропна дія альфакальцидолу пов’язана з позитивним впливом на міцність кістки, метаболізм, профілактику падінь та переломів. Доведено, що активні метаболіти вітаміну D беруть безпосередню участь у регенерації, впливаючи на метаболізм кістки та формування регенерату, накопичуються у травмованій ділянці та стимулюють проліферацію і диференціювання остеобластів [10]. Дефіцит D-гормона може супроводжуватися порушенням регенерації [4].

Мета дослідження: вивчити в експерименті на тваринах старечого віку регенерацію кістки під дією альфакальцидолу.

Матеріали та методи

Експериментальні дослідження проведено на 20 білих лабораторних щурах (віком 24 місяці) популяції ДУ «Інститут геронтології імені Д.Ф. Чеботарьова НАМН України» у двох серіях експерименту:

1-ша серія: відтворення травматичного ушкодження у старих щурів без лікування.

2-га серія: відтворення травматичного ушкодження у старих щурів, лікування альфакальцидолом.

Експерименти на тваринах виконані відповідно до вимог «Європейської конвенції захисту хребетних тварин, які використовуються в експериментальних й інших цілях» і Закону України [11, 12]. План експерименту і тактика його виконання заслухані та затверджені комітетом з питань біоетики ДУ «Інститут геронтології НАМН України».

У щурів моделювали транскортикальний наскрізний дефект у ділянці дистального метадіафіза стегнової кістки за допомогою стоматологічного бору діаметром 1 мм. Оперативне втручання виконували під загальним внутрішньом’язовим наркозом (аміназин — 10 мг/кг, кетамін — 50 мг/кг) за умов асептики. Тварини у післяопераційному періоді перебували під постійним наглядом. Після виконання оперативного втручання в усіх серіях експерименту проводилася симптоматична медикаментозна терапія. Альфакальцидол (торговельна назва «Альфа D3-Тева») у дозі 0,1 мкг/кг маси тіла вводили щурам зранку per os через зонд у суспензії дистильованої води, починаючи з 2-ї доби після операції до виведення тварин з експерименту (через 10-ту і 30-ту добу) шляхом передозування ефіру для наркозу. Контрольним щурам вводили дистильовану воду. Дозу альфакальцидолу для щурів розраховували відповідно до конвертації дози, що призначається людині, за наступною формулою [13]:

Еквівалентна доза людини (мг/кг) = 0,0001* (мг/кг) х х (7:37)** = 0,000019 мг/кг, для людини вагою 80 кг = 0,0015 мг або 1,5 мкг.

Примітки: * — 0,1 мкг альфакальцидолу = 0,0001 мг; ** — перерахунок дози мг/кг у дозу в мг/м2 тварини: 7 мг/м2 для щура масою тіла 250 г, для людини 37 мг/м2.

Згідно з інструкцією альфакальцидол може бути призначений у дозуванні 1–3 мкг/д. Доза, яку вводили щурам, є середньою.

Для гістологічних досліджень стегнову кістку щурів з ділянкою травматичного ушкодження фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, декальцинували в розчині 4% азотної кислоти, зневоднювали у спиртах зростаючої міцності та поміщали в целоїдин [14]. Виготовляли гістологічні зрізи на санному мікротомі Reichert, забарвлювали їх гематоксиліном і еозином, а також пікрофуксином за Ван Гізоном. Забарвлені зрізи аналізували в мікроскопі MICROS. Фотографували препарати за допомогою цифрової фотокамери Canon EOS 300D під мікроскопом AxioStar Plus.

Морфометричні дослідження виконували для порівняльного аналізу динаміки формування кісткового регенерату між контрольною та дослідною серією щурів. Визначали тканини, що заповнюють ділянку травматичного ушкодження по території дефекту в регенератах медіальної та латеральної частин кістки. Досліджували площу (на зрізах) новоутворених тканин (сполучної та кісткової) у ділянці дефектів за методикою Г.Г. Автандилова [14]. Морфометричні дослідження регенерату виконували на 5 тваринах (на 10-ту і –30-ту добу), оцінювали по 2 зрізи, що були отримані від кожної тварини.

Статистичний аналіз отриманих даних здійснювали за допомогою програми Microsoft Office Excel 2007. Результати подавали як середнє ± стандартна помилка середнього (M ± m). Після перевірки нормальності розподілу ряду (тест Шапіро — Уїлка) для оцінки відмінностей між двома незалежними вибірками використовували непараметричний тест Манна — Уїтні. Якщо отримане значення (Uемп) було менше ніж табличне або дорівнювало йому (Uкрит. ≥ Uемп.), то визнавали наявність суттєвої різниці між рівнем ознаки в аналізованих вибірках, тобто приймали альтернативну гіпотезу, а нульову гіпотезу спростовували. Статистичну значущість оцінювали при р < 0,05.

Результати

На 2-гу та 3-тю добу після відтворення травматичного ушкодження тварини в обох серіях експерименту припадали на оперовану кінцівку. З 4-ї доби тварини спиралися на кінцівку, були активними й нормально харчувалися.

На 10-ту добу у старих тварин без лікування у крайових відділах регенерату, розташованих у зоні кортекса (з боку латеральної та медіальної ділянок стегнової кістки), спостерігалися схожі репаративні прояви.

Регенерати у крайових відділах дефекту були представлені фіброретикулярною (сполучною) тканиною з високою щільністю фібробластів, розташованих серед колагенових волокон, ділянок остеоїду та новоутворених кісткових трабекул (рис. 1). Поодинокі кровоносні судини мали вузький діаметр. Прилегла до ділянки дефекту материнська кістка (кортекс і кісткові трабекули) була без остеоцитів, що може бути пов’язано з механічним утворенням дефекту. Над зоною травматичного ушкодження розташовувався сформований періост із колагенових волокон з низькою щільністю фібробластів.

На відстані від дефекту в кортикальній тканині відзначали розширені резорбційні порожнини, які нещільно заповнені фіброретикулярною тканиною, та розширені кісткові канальці. У кортексі щільність остеоцитів була низькою, у цих ділянках кістка була нерівномірно забарвлена гематоксиліном та еозином, у матриксі виявлено ділянки лізису чи нерівномірної кальцифікації.

У регенератах тварин, яких лікували альфакальцидолом, на 10-ту добу переважала кісткова тканина, що представлена щільною мережею потовщених кісткових трабекул грубоволокнистої будови з високою щільністю остеобластів і поодиноких остеоцитів, розташованих у вузьких лакунах (рис. 2). Крайові відділи кісткових трабекул були щільно вкриті остеобластами. У вузьких міжтрабекулярних просторах і на невеликих ділянках регенерату розташовувалася фіброретикулярна тканина з фібробластами та кровоносні судини дрібного калібру. Прилегла материнська кістка на деяких ділянках без остеоцитів була щільно спаяна з новоутвореними кістковими трабекулами, а в резорбційних порожнинах кістки сформована фіброретикулярна тканина. Кортикальна тканина з боку як латеральної, так і медіальної сторони стегнової кістки мала ознаки реактивних перебудов.

На 30-ту добу в контрольній групі тварин фрагменти кортекса були з’єднані кістковим регенератом, який був значно потоншений порівняно з кортексом материнської кістки. Крім того, у тварин щільного зрощення регенерату з кортексом не виявлено, сформовані кісткові структури були переривчасті та фрагментарні. Нижче від кортекса розташовувалися кісткові трабекули, більшість з яких фрагментовані й не формували анастомозів, вкриті поодинокими остеоцитами, виявлялися й лакуни без клітин (рис. 3А). У порожнинах кортекса та між кістковими трабекулами губчастої кістки розташований червоний і жовтий кістковий мозок.

З боку медіальної поверхні стегнової кістки в зоні травматичного ушкодження був сформований кістковий регенерат, що щільно поєднував фрагменти кортекса, проте на ділянках новоутворених кісткових трабекул виявлялися вогнища лізису, тріщини та щілини (рис. 3Б).

Над ділянкою регенерату був розташований періост, однак він був потоншеним, пухким і складався з фіброзного шару з низькою щільністю фібробластів. Остеогенний шар мав поодинокі остеобласти.

На 30-ту добу в ділянці дефекту тварин, яких лікували альфакальцидолом, виявлено, що в латеральній і медіальній ділянках стегнової кістки сформований кістковий регенерат скріплює фрагменти кортекса (рис. 4).

Він складався з пластинчастої кістки з високою щільністю остеоцитів, що відрізняло його від кортекса материнської кістки. Регенерат у ділянці губчастої кістки виконаний дрібнопетлястою мережею кісткових трабекул, виявлялись апозиційні напластування новоствореної кісткової тканини. Кортекс, що прилягав до зони дефекту, відзначався безклітинними ділянками. Над зоною травматичного ушкодження був сформований періост, представлений фіброзним шаром з пучками колагенових волокон та фібробластами проміж ними. Остеогенний шар періосту на поверхні кісткової тканини регенерату був потовщений. З боку медіальної ділянки стегнової кістки в дефекті розташовувалася пластинчаста кістка з високою щільністю остеобластів.

Для об’єктивізації даних гістологічного дослідження на 30-ту добу було проведено морфометричне дослідження відносного об’єму кісткової тканини регенератів з боку медіальної та латеральної ділянок стегнової кістки (табл. 1).

Аналіз тканин, що формують регенерат (кісткової та фіброретикулярної тканин із кістковим мозком) продемонстрував, що показники кісткової тканини в регенератах тварин після лікування значно перевершували показники тварин без лікування альфакальцидолом. Так, у тварин, які отримували альфакальцидол на тлі травматичного ушкодження, площа кісткової тканини в латеральних та медіальних ділянках дефекту була збільшена порівняно з тваринами без лікування. Вірогідні відмінності виявлено й за показником фіброретикулярної тканини та кісткового мозку, площа яких у регенератах тварин без лікування була розширена порівняно з тваринами, яких лікували альфакальцидолом. У тварин старечого віку виявлена варіабельність в організації регенератів з боку латеральної та медіальної поверхонь стегнової кістки, що полягає в перерозподілі площ кісткової, фіброретикулярної тканини та кісткового мозку. Так, вірогідні відмінності виявлено у групі тварин старечого віку: з боку латеральної ділянки стегнової кістки площа кісткової тканини в регенератах була знижена порівняно з медіальною, що супроводжувалося підвищенням в регенераті фіброретикулярної тканини.

Аналіз тканин, які формують регенерат (кісткова та фіброретикулярна тканини з кістковим мозком) продемонстрував, що показники відносної площі в регенератах тварин після лікування статистично значуще відрізнялися від показників тварин без лікування альфакальцидолом, оскільки емпіричне значення критерію було менше за табличне, нульова гіпотеза відкидалася на вибраному рівні значимості.

У тварин старечого віку виявлена варіабельність в організації регенератів з боку латеральної та медіальної поверхонь стегнової кістки, яка полягала в перерозподілі площ кісткової, фіброретикулярної тканини та кісткового мозку.

Обговорення

Регенерація тканин і органів посідає провідні позиції серед актуальних проблем медицини та біології. З віком онкологічні й дегенеративні захворювання, інфекції та запальні стани збільшуються, тоді як репаративні потенції організму зменшуються [1, 16]. Складні біологічні процеси, які відбуваються під час старіння кісток, відбиваються й на регенерації кістки. Це потребує розробки методів, що оптимізують або стимулюють регенерацію кістки в умовах патофізіологічних змін при старінні, серед яких важливе місце посідають лікарські препарати, що впливають на метаболізм кістки та сприяють диференціюванню клітин [17, 18]. Преклінічні експериментальні дослідження на тваринах дають змогу виявити основні ланки регенерації кістки за різних умов [19]. Відзначено порушення регенерації у тварин 50-тижневого віку після відтворення діафізарного перелому за механічними показниками та накопичення мінералів у ділянці перелому в умовах формування регенерату [1]. Проте більшість досліджень проводять на тваринах молодого та зрілого віку або в умовах моделювання остеопорозу. У раніше проведеному нами дослідженні на тваринах з остеопорозом було виявлено, що альфакальцидол знижує остеопоротичні порушення в кістці та стимулює остеогенез [20]. Аналогічна спрямованість морфогенезу регенерату наведена і в цьому дослідженні, у якому використано щурів старечого віку для визначення морфогенезу регенерації кістки в умовах модельованого наскрізного транскортикального дефекту та лікування тварин альфакальцидолом. Доведено, що на ранній термін (10 діб) у щурів старечого віку відбувається затримка формування кісткової тканини в регенераті. Використання альфакальцидолу сприяло формуванню в дефекті грубоволокнистої кісткової тканини трабекулярної організації з високою щільністю остеобластів, а на 30-ту добу кісткова тканина регенерату була більш зріла порівняно з тваринами без лікування. Площа кісткової тканини в регенераті збільшувалася.

Анаболічна дія альфакальцидолу на кісткову тканину регенерату може бути пов’язана з тим, що D-гормон стимулює експресію трансформуючого фактора росту β та інсуліноподібного фактора росту 2, підвищує щільність рецепторів інсуліноподібного фактора росту 1, що стимулює проліферацію остеобластів [21]. Наявність фізіологічного рівня D-гормона в сироватці крові також має велике значення для мінералізації регенерату та ремоделювання кістки [4].

Таким чином, при переломах альфакальцидол може бути успішно використаний як доповнення до стандартної комплексної терапії з позитивним впливом на зрілість і якість кісткового регенерату, зниження розвитку деструктивних порушень у кістковій тканині, що оточує дефект.

Обмеження дослідження. Дані, що наведені, отримані внаслідок дослідження дефекту в метадіафізарній ділянці стегнової кістки, яка багата на трабекулярну кістку з остеобластами на кісткових трабекулах, які беруть участь у формуванні регенерату. За термінами та спрямованістю регенерація в дефектах, що відтворені в діафізарний ділянці, може відрізнятися, що потребує додаткових досліджень.

Висновок

Лікування тварин альфакальцидолом після травматичного ушкодження стегнової кістки сприяє прискоренню формування кісткової тканини в ділянці дефекту та приводить до зниження деструктивних проявів у кістці навколо дефекту порівняно з тваринами без лікування.

Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів та власної фінансової зацікавленості при підготовці цієї статті.

Дослідження було фрагментом науково-дослідної роботи відділу клінічної фізіології та патології опорно-рухового апарату Державної установи «Інститут геронтології імені Д.Ф. Чеботарьова НАМН України» («Дефіцит вітаміну D та захворювання кістково-м’язової системи (остеопороз, остеоартроз) у людей різного віку», шифр 56.09, держреєстрація № 0109U001721). Установою, що фінансує дослідження, є Національна академія медичних наук України.

Інформація про внесок кожного автора. Клімовицький В.Ф. — аналіз літератури, написання статті; Клімовицький В.Г. — концепція та дизайн дослідження; Дєдух Н.В. — збір і аналіз літератури, редагування статті.

Отримано/Received 14.11.2022

Рецензовано/Revised 30.11.2022

Прийнято до друку/Accepted 05.12.2022

Список литературы

Meyer R.A., Tsahakis P.J., Martin D.F., et al. Age and ovariectomy impair both the normalization of mechanical properties and the accretion of mineral by the fracture callus in rats. J. Orthop. Res. 2001. 19(3). 428-435. doi: 10.1016/S0736-0266(00)90034-2.
Borgiani E., Figge C., Kruck B. et al. Age-Related Changes in the Mechanical Regulation of Bone Healing Are Explained by Altered Cellular Mechanoresponse. Journal of Bone and Mineral Research (JBMR). 2019. 34(10). 1923-1937. doi: 10.1002/jbmr.3801.
Pollock F.H., Maurer J.P., Sop A. et al. Humeral shaft fracture healing rates in older patients. Orthopedics. 2020. 43(3). 168-172. doi: 10.3928/01477447-20200213-03.
Korzh N.A., Dedukh N.V., Horidova L.D. et al. Alfacalcidol in bone regeneration. Orthopedics, traumatology and prosthetics. 2013. 1. 73-83. doi: 10.15674/0030-59872013173-83.
Liu D., Qin H., Yang J., et al. Different effects of Wnt/β-catenin activation and PTH activation in adult and aged male mice metaphyseal fracture healing. BMC Musculoskelet Disord. 2020 Feb 19. 21(1). 110. doi: 10.1186/s12891-020-3138-3.
Gibon E., Lu L.Y., Nathan K., Goodman S.B. Inflammation, ageing, and bone regeneration. J. Orthop. Translat. 2017 Jul. 10. 28-35. doi: 10.1016/j.jot.2017.04.002.
Gruber R., Koch H., Doll B.A., Tegtmeier F., Einhorn T.A., Hollinger J.O. Fracture healing in the elderly patient. Exp. Gerontol. 2006 Nov. 41(11). 1080-93. doi: 10.1016/j.exger.2006.09.008.
Newman H., Shih Y.V., Varghese S. Resolution of inflammation in bone regeneration: From understandings to therapeutic applications. Biomaterials. 2021. 277. 121114. doi: 10.1016/j.biomaterials.2021.121114.
Chen C.H., Wang L., Tulu U.S. et al. An osteopenic/osteoporotic phenotype delays alveolar bone repair. Bone. 2018. 112. 212-219. doi: 10.1016/j.bone.2018.04.019.
Gurlek A., Pittelkow M.R., Kumar R. Modulation of growth factor/cytokine synthesis and signaling by 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D(3): implications in cell growth and differentiation. Endocr. Rev. 2002 Dec. 23(6). 763-786. doi: 10.1210/er.2001-0044.
European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. Strasburg. 1986. ETS No. 123. Available from: https://rm.coe.int/168007a67b.
Law of Ukraine On Protection of Animals from Cruelty. Information of the Verkhovna Rada of Ukraine 2006. № 27. Аrt. 230. Available from: https://zakon.rada.gov.ua/laws/show/3447-15#Text.
Nair A.B., Jacob S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J. Basic. Clin. Pharm. 2016 Mar. 7(2). 27-31. doi: 10.4103/0976-0105.177703.
Sarkisov D.S., Perova Yu.L. Microscopic technique. М.: Medicine, 1996. 542.
Avtandilov G.G. Medical morphometry: [manual]. M.: Medicine, 1990. 384.
Ansari M. Bone tissue regeneration: biology, strategies and interface studies. Prog. Biomater. 2019 Dec. 8(4). 223-237. doi: 10.1007/s40204-019-00125-z.
Aspenberg P. Special Review: Accelerating fracture repair in humans: a reading of old experiments and recent clinical trials. Bonekey Rep. 2013 Jan. 9. 2. 244. doi: 10.1038/bonekey.2012.244.
Gao Y., Liu X., Gu Y. et al. The Effect of Bisphosphonates on Fracture Healing Time and Changes in Bone Mass Density: A Meta-Analysis. Front. Endocrinol. 2021. 12. 688269. doi: 10.3389/fendo.2021.688269.
Klontzas M.E., Kenanidis E.I., Mac Farlane R.J. et al. Investigational drugs for fracture healing: preclinical & clinical data. Expert Opin. Investig. Drugs. 2016. 25(5). 585-96. doi: 10.1517/13543784.2016.1161757.
Поворознюк В.В., Климовицкий Ф.В., Дедух Н.В. Морфологические особенности регенерации транскортикального метадиафизарного дефекта при лечении животных альфакальцидолом. Український медичний альманах. 2013. 16(1). 35-39. Режим доступу: http://nbuv.gov.ua/UJRN/Uma_2013_16_1_10.
van Driel M., Pols H.A., van Leeuwen J.P. Osteoblast differentiation and control by vitamin D and vitamin D metabolites. Curr. Pharm. Des. 2004. 10(21). 2535-2555. doi: 10.2174/1381612043383818.