Резюме
Актуальність. Завдяки 3D-друку стало можливим виготовлення імплантатів за заданими геометричними параметрами і хімічним складом, а також матриць і каркасів для створення комбінованих імплантатів, які відповідають вимогам щодо основних характеристик остеопластичних матеріалів, а саме: мають високу здатність до остеокондукції, остеоіндукції, остеоінтеграції, біосумісність і механічну міцність, придатні для забезпечення міграції, адгезії, проліферації і диференціювання клітин. Мета: в експерименті на тваринах рентгенометрично вивчити динаміку заміщення кістковою тканиною пористих 3D-друкованих імплантатів на основі полілактиду з трикальційфосфатом після застосування мезенхімальних стромальних клітин (МСК) жирової тканини. Матеріали та методи. На 18 лабораторних щурах проведено рентгенометричне дослідження щільності кісткового регенерату в різні терміни після імплантації в порожнинний дефект стегнової кістки біорозкладаного матеріалу на основі полілактиду з додаванням трикальційфосфату і застосування культивованих мезенхімальних стромальних клітин. Щурів виводили з експерименту групами по 6 тварин через 15, 30 і 90 діб після операції. Вимірювали показники оптичної щільності в зоні кісткового дефекту оперованої кістки та в аналогічній зоні контралатеральної кістки. Результати. На 15-ту добу після операції оптична щільність імплантата була вище, ніж аналогічної зони інтактної кістки. Через 1 місяць щільність імплантата знизилася, але залишилася трохи більшою, ніж щільність кістки, тобто біорозкладання імплантованого матеріалу відбулося не повністю. Через 3 місяці після операції спостерігали вирівнювання оптичної щільності зони імплантації та інтактної кістки. Можна припустити, що відбулося повне біорозкладання імплантата, а дефект був заповнений кістковою тканиною. Зниження оптичної щільності в зоні дефекту через 1 міс. після операції викликане саме процесами біорозкладання штучного матеріалу і кісткоутворення, які не збігаються за швидкістю перебігу. На жодному етапі експерименту різниці між імплантатами при застосуванні культури МСК і без неї на статистично значущому рівні не визначено. Висновки. Протягом експерименту щільність інтактної кісткової тканини щурів статистично значуще зростала. У зоні дефекту стегнової кістки в період із 15-ї до 30-ї доби спостерігали зниження оптичної щільності від 180 ± 28 опт.од. до 168 ± 25 опт.од., що може свідчити про початок процесу біорозкладання 3D-друкованого імплантаційного матеріалу, яким заповнений дефект. У термін від 30-ї до 90-ї доби в зоні дефекту спостерігали зростання оптичної щільності до 184 ± 2 опт.од., що наблизилося до рівня інтактної кістки — 182 ± 1 опт.од., про що свідчить відсутність статистичної значущості між цими показниками. Це може буди наслідком процесу кісткоутворення й заміщення імплантованого матеріалу кістковою тканиною. На жодному етапі експерименту не виявлено різниці між імплантатами з використанням культури МСК і без неї.
Background. Thanks to 3D printing, it became possible to manufacture implants of given geometric parameters and chemical composition, as well as matrices and frameworks for the creation of combined implants that are able to meet the requirements for the main characteristics of osteoplastic materials, namely a high ability for osteoconduction, osteoinduction, osseointegration, biocompatibility and mechanical strength, suitable for ensuring migration, adhesion, proliferation and differentiation of cells. Goal: in an experiment on animals, to study radiometrically the dynamics of replacement by bone tissue of porous 3D printed implants based on polylactide with tricalcium phosphate after the use of mesenchymal stromal cells (MSCs) of adipose tissue. Materials and methods. A radiometric study of the density of bone regeneration was carried out on 18 laboratory rats at different times after implantation into a cavity defect of the femur of a biodegradable material based on polylactide with the addition of tricalcium phosphate and the use of cultured MSCs. Rats were sacrificed in groups of 6 animals 15, 30 and 90 days after the operation. Optical density indicators were measured in the area of the bone defect of the operated bone and in the similar area of the contralateral bone. Results. On day 15 after the operation, the optical density of the implant is higher than that of a similar zone of intact bone. One month after, the density of the implant decreased, but remained slightly higher than the density of the bone, that is, the biodegradation of the implant material was not complete. Three months after the operation, the alignment of the optical density of the implantation zone and the intact bone was observed. It can be assumed that complete biodegradation of the implant occurred and the defect was filled with bone tissue. Reduction of optical density in the defect zone 1 month after surgery was caused by the processes of biodegradation of the artificial material and bone formation, which do not coincide in terms of speed. There was no statistically significant difference between the implants in case of using MSC culture and without it at any stage of the experiment. Conclusions. During the experiment, the density of intact bone tissue of rats increased statistically significantly. In the area of the femur defect, there was a decrease in optical density from 180 ± 28 HU to 168 ± 25 HU from day 15 to 30, which may indicate the beginning of the process of biodegradation of the 3D printed implant material that filled the defect. In the period from 30 to 90 days, an increase in optical density in the defect zone was observed up to 184 ± 2 HU, which approached the level of intact bone — 182 ± 1 HU, as evidenced by the lack of statistical significance between these indicators. This may be a consequence of the process of bone formation, and replacement of the implanted material with bone tissue. No difference was found between the implants with and without MSC culture at any stage of the experiment.
Вступ
На сьогодні стрімкий розвиток 3D-технологій створив умови для впровадження в клінічну практику інноваційних розробок стосовно пластики дефектів кісток різної етіології. Завдяки тривимірному друку стало можливим виготовлення імплантатів за заданими геометричними параметрами й хімічним складом, а також матриць і каркасів для створення комбінованих імплантатів, які відповідають вимогам щодо основних характеристик остеопластичних матеріалів, а саме: мають високу здатність до остеокондукції, остеоіндукції, остеоінтеграції та демонструють біосумісність і механічну міцність [1–5].
У процесі пошуку нових рішень щодо заміщення втраченої кісткової тканини склався перспективний напрямок, пов’язаний з розробкою біорозкладаних імплантатів, які після відновлення кістки не потребують видалення, тобто повторного хірургічного втручання. Найбільш поширеним серед біорозкладаних полімерів у сучасній ортопедичній хірургії виявився полілактид (ПЛА) як основний компонент для виготовлення 3D-друкованих імплантатів. Матеріали на основі полілактиду постійно піддають модифікаціям, щоб створити оптимальні умови для забезпечення балансу між швидкістю біорозкладання імплантата і швидкістю його заміщення новосформованою кістковою тканиною пластинчастої (зрілої) будови. Керування цими процесами досягають за рахунок додавання до полілактиду в різних пропорціях мінеральних компонентів (гідроксилапатит, трикальційфосфат (ТКФ)) і зміни геометричної структури імплантатів (розмір пор, пористість, форма поверхонь) [6, 7], а також застосування різних остеоіндуктивних факторів для посилення репаративного остеогенезу (збагачені тромбоцитами плазма й фібрин, мезенхімальні стромальні клітини (МСК) кісткового мозку й жирової тканини).
Щодо нових модифікацій біорозкладаних імплантатів є пропозиція виготовляти їх на 3D-принтері з композитної нитки на основі полілактиду й трикальційфосфату за заданими параметрами пористості, імітуючи будову остеонних конструкцій кісткової тканини [8]. Надруковані мінерал-полімер-композитні імплантати мають вигляд матриці або каркаса, придатного для забезпечення міграції, адгезії, проліферації та диференціювання клітин.
Для оцінювання особливостей перебудови створених біорозкладаних імплантатів і перебігу репаративного остеогенезу проводять експериментальні дослідження з використанням тварин на моделі остеопластики стандартного дірчастого (порожнинного) дефекту, що зачіпає ділянки губчастої та компактної кістки.
Мета: в експерименті на тваринах рентгенометрично вивчити динаміку заміщення кістковою тканиною пористих 3D-друкованих імплантатів на основі полілактиду з трикальційфосфатом після застосування мезенхімальних стромальних клітин жирової тканини.
Матеріали та методи
У лабораторії біомеханіки ДУ «Інститут патології хребта та суглобів ім. проф. М.І. Ситенка НАМН України» було проведено рентгенометричне дослідження щільності кісткового регенерату в різні терміни після імплантації в порожнинний дефект стегнової кістки щурів біорозкладаного матеріалу на основі полілактиду з додаванням трикальційфосфату і застосування культивованих мезенхімальних стромальних клітин.
Експеримент проведено на 18 лабораторних білих щурах (вік — 5 міс., жива маса тіла — від 200 до 260 г на початок експерименту) популяції експериментально-біологічної клініки ДУ «Інститут патології хребта та суглобів ім. проф. М.І. Ситенка НАМН України» з дотриманням вимог гуманного ставлення до піддослідних тварин [9–11]. Хірургічні втручання виконували тваринам в умовах асептики й антисептики під загальним знеболюванням кетаміном (внутрішньом’язово 50 мг/кг). План експериментального дослідження схвалений локальним комітетом з біоетики (протокол № 217 від 14.06.2021).
Імплантаційний матеріал друкували на 3D-принтері Easy3DPrint методом наплавлення композитної нитки, виготовленої із суміші ПЛА і ТКФ (17 : 8). У на-друкованому матеріалі переплетіння нитки формують вертикальні й горизонтальні канали-пори (розмір пор 300 мкм, пористість 45 %). Для експерименту цій матеріал механічно розділяли на фрагменти — зразки циліндричної форми діаметром 2,5 мм і довжиною 3 мм (рис. 1).
МСК жирової тканини отримували хірургічно з великого сальника щурів і культивували в середовищі DMEM з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (Biowest, Франція) на базі відділення трансплантології системи опори та руху ДУ «Інститут патології хребта та суглобів ім. проф. М.І. Ситенка НАМН України». Термін культивування МСК становив 14 діб.
Усім тваринам за допомогою фісурного бора виконували порожнинний дефект у дистальному метафізі лівої стегнової кістки латерально. Дефект заповнювали зразком з 3D-друкованого імплантаційного матеріалу.
Ін’єкцію 0,2 мл культурального середовища з МСК (106 клітин) вводили в ділянку хірургічного втручання через 7 діб після імплантації, тобто на термін, якій відповідає стадії формування тканиноспецифічних структур у процесі репаративного остеогенезу.
Щурів виводили з експерименту групами по 6 тварин через 15, 30 і 90 діб після операції, виділяли оперовані й контралатеральні стегнові кістки, після чого виконували їх рентгенограми. Для усунення похибок, пов’язаних з різною якістю рентгенограм (яскравість, контрастність тощо), кістки всієї виведеної групи подавали на одному знімку. Для усунення різниці між знімками, виконаними в різні терміни після операції, використовували тест-об’єкт (рис. 2).
На рентгенограмах вимірювали показники оптичної щільності (в одиницях градації сірого) в зоні кісткового дефекту оперованої кістки і в аналогічній зоні контралатеральної кістки (контрольна група). Також виконували вимірювання оптичної щільності тест-об’єкта в його верхньому правому куті. Показник оптичної щільності тест-об’єкта на рентгенограмі кісток через 15 діб після операції був прийнятий за одиницю. Для рентгенограм кісток тварин, виведених з експерименту на 30-ту й 90-ту добу після операції, за показниками оптичної щільності тест-об’єкта визначали поправочний коефіцієнт, на який множили показники щільності зображених на них кісток. Вимірювання оптичної щільності виконували за допомогою програмного комплексу X-rays (рис. 3), розробленого в Харківському національному університеті радіоелектроніки [12–14].
/6.jpg)
Дані експерименту були оброблені статистично. Розраховували середнє (М), стандартне відхилення (SD), мінімальне (min) і максимальне (max) значення вибірки. Порівняння значень оптичної щільності на контралатеральних кінцівках проводили за допомогою Т-тесту для парних вибірок [15]. Також проводили порівняння з показниками оптичної щільності кісток з дефектом, заповненим тільки матеріалом на основі полілактиду з трикальційфосфатом без застосування МСК, які були опубліковані в нашій попередній роботі [16], для чого також використовували Т-тест для парних вибірок.
Результати
Було проведено аналіз зміни оптичної щільності зони дефекту на оперованій кінцівці та інтактної кістки на тому ж рівні в процесі спостереження. Результати наведені в табл. 1.
За даними статистичного аналізу було визначено, що на 15-ту добу після операції оптична щільність зони дефекту становила в середньому 180 ± 28 опт.од., що було статистично значущо (р = 0,005) більше, ніж оптична щільність аналогічної зони на інтактній кістці — 145 ± 31 опт.од.
Через 1 місяць спостерігали зменшення оптичної щільності зони дефекту до 168 ± 25 опт.од., при цьому в такій же зоні на інтактній кінцівці вона збільшилася до 153 ± 15 опт.од. Через 1 місяць після операції оптична щільність кісток вирівнялася до статистично близького рівня (р = 0,125).
На 3-й місяць спостереження міцність зони дефекту досягла рівня 184 ± 2 опт.од. і наблизилася до рівня інтактної кістки — 182 ± 1 опт.од., що статистично однаково (р = 0,930).
Динаміку оптичної щільності кісткової тканини в щурів у процесі спостереження наведено на графіку (рис. 4).
На даному графіку показано, що на 15-ту добу після операції оптична щільність імплантата вище, ніж аналогічної зони інтактної кістки. Через місяць щільність імплантата знизилася, але залишилася трохи більшою, ніж щільність кістки, тобто біорозкладання імплантованого матеріалу відбулося не повністю. Через 3 місяці після операції спостерігали вирівнювання оптичної щільності зони імплантації та інтактної кістки. Тобто можна припустити, що відбулося повне біорозкладання імплантата й дефект був заповнений кістковою тканиною. Зниження оптичної щільності в зоні дефекту через 1 міс. після операції викликане саме процесами біорозкладання штучного матеріалу й кісткоутворення, які не збігаються за швидкістю перебігу.
У табл. 2 наведено результати порівняльного аналізу динаміки оптичної щільності зони дефекту й інтактної кістки протягом часу експерименту.
Як показали результати статистичного аналізу, щільність кісткової тканини щурів статистично значуще зростала протягом експерименту, про що свідчать показники щільності інтактних кісток у термін від 15-ї до 90-ї доби, коли щільність змінювалась від 145 ± 31 опт.од. до 181 ± 1 опт.од., що виявилось статистично значущим на рівні р = 0,01. На межі статистичної значущості (р = 0,055) спостерігали зростання щільності й у період між 30-ю і 90-ю добою — від 153 ± 15 опт.од. до 182 ± 1 опт.од. На етапі між 15-ю і 30-ю добою статистичної значущості зміни оптичної щільності інтактної кісткової тканини не спостерігали (р = 0,677), що пов’язано, на нашу думку, з коротким часовим проміжком між даними етапами експерименту.
Що стосується зони дефекту стегнової кістки, то в ній статистично значущих змін оптичної щільності не виявлено в жодному періоді експерименту.
Це пов’язано передусім з різною спрямованістю динаміки процесу. Так, у період з 15-ї до 30-ї доби спостерігали зниження оптичної щільності в зоні дефекту від 180 ± 28 опт.од. до 168 ± 25 опт.од. (р = 0,57), що свідчить про запуск процесу біорозкладання 3D-друкованого імплантаційного матеріалу, яким заповнювали дефект. У період від 30-ї до 90-ї доби, навпаки, визначається зростання оптичної щільності до 184 ± 2 опт.од., що може бути наслідком процесу кісткоутворення й заміщення імплантата кістковою тканиною, але статистичної значущості змін також не визначено (р = 0,756).
На останньому етапі роботи був проведений порівняльний статистичний аналіз змін оптичної щільності кісток щурів з дефектом, заповненим матеріалом на основі полілактиду з трикальційфосфатом, і застосуванням культури МСК порівняно з кістками тварин, у яких дефект був заповнений тим самим матеріалом, але без ін’єкційного введення МСК, що були детально описані в нашому попередньому дослідженні [16]. Показники оптичної щільності кісток тварин обох експериментальних груп наведені в табл. 3.
Проведений порівняльний аналіз величин оптичної щільності кісткової тканини тварин залежно від матеріалу, яким заповнювали кістковий дефект, показав, що на жодному етапі експерименту різниці між імплантатами із застосуванням культури МСК і без неї на статистично значущому рівні не визначено. Також не визначено статистично значущої різниці щодо оптичної щільності інтактних кісток, що цілком очікувано.
Наочне уявлення про зміни оптичної щільності кісткової тканини щурів в обох експериментальних групах можна отримати за допомогою графіка, який наведено на рис. 5.
На наведеному графіку можна побачити, що через місяць після оперативного втручання оптична щільність зони дефекту, заповненого матеріалом з додаванням культури МСК, була дещо вище, ніж у групі без неї. Хоча різниця показника не досягла статистичної значущості (р = 0,781), можна припустити, що це може бути наслідком або прискорення процесу кісткоутворення, або гальмування швидкості біорозкладання імплантованого матеріалу, але більш точну відповідь на це питання можна буде отримати за результатами морфологічних досліджень.
Висновки
1. Протягом експерименту щільність інтактної кісткової тканини щурів статистично значуще (р = 0,01) зростала, що пов’язано зі збільшенням віку тварин.
2. У зоні дефекту стегнової кістки в період із 15-ї до 30-ї доби спостерігали зниження оптичної щільності від 180 ± 28 опт.од. до 168 ± 25 опт.од., що може свідчити про початок процесу біорозкладання 3D-друкованого імплантаційного матеріалу, яким заповнений дефект.
3. У термін від 30-ї до 90-ї доби в зоні дефекту спостерігали зростання оптичної щільності до 184 ± 2 опт.од., що наблизилося до рівня інтактної кістки — 182 ± 1 опт.од., про що свідчить відсутність статистичної значущості між цими показниками (р = 0,93). Це може буди наслідком процесу кісткоутворення й заміщення імплантованого матеріалу кістковою тканиною.
4. Аналіз статистично значущої різниці величин оптичної щільності кісткової тканини тварин при заповненні кісткового дефекту 3D-друкованим імплантаційнім матеріалом показав, що на жодному етапі експерименту не виявлено різницю між імплантатами з використанням культури МСК і без неї.
Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів і власної фінансової зацікавленості при підготовці даної статті.
Отримано/Received 07.11.2022
Рецензовано/Revised 15.11.2022
Прийнято до друку/Accepted 24.11.2022
Список литературы
1. Ansari M.A.A., Golebiowska A.A., Dash M. et al. Engineering biomaterials to 3D-print scaffolds for bone regeneration: practical and theoretical consideration. Biomater. Sci. 2022. Vol. 10. Issue 11. P. 2789-2816. DOI: 10.1039/d2bm00035k.
2. Feng Y., Zhu S., Mei D. et al. Application of 3D printing technology in bone engineering: A Review. Curr. Drug Deliv. 2021. Vol. 18. Issue 7. P. 847-861. DOI: 10.2174/1567201817999201113100322.
3. Turnbull G., Clarke J., Picardet F. et al. 3D bioactive composite scaffolds for bone tissue engineering. Bioactive Materials. 2018. Vol. 3. Issue 3. P. 278-314. DOI: 10.1016/j.bioactmat.2017.10.001.
4. Roohani-Esfahani S.I., Newman P., Zreiqat H. Design and fabrication of 3D printed scaffolds with a mechanical strength comparable to cortical bone to repair large bone defects. Scientific Reports. 2016. 6. 19468. DOI: 10.1038/srep19468.
5. Wubneh A., Tsekoura E.K., Ayranci C., Uludağ H. Current state of fabrication technologies and materials for bone tissue engineering. Acta Biomater. 2018. Vol. 80. P. 1-30. DOI: 10.1016/j.actbio.2018.09.031.
6. Rakovsky А., Gotman I., Rabkin E., Gutmanas E.Y. β-TCP-polylactide composite scaffolds with high strength and enhanced permeability prepared by a modified salt leaching method. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2014. Vol. 32. P. 89-98. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jmbbm.2013.12.022.
7. Deng M., Kumbar S.G., Lo K.W.-H. et al. Novel polymer-ceramics for bone repair and regeneration. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 2011. Vol. 4. Issue 3. P. 168-184. DOI: 10.2174/1874764711104030168.
8. Пастух В.В. Патент України на корисну модель № 146418 UA, МПК A61L 27/00, A61F 2/02, A61В 6/03, A61В 17/56 (2006.01). Спосіб отримання композиційного імплантата для заміщення дефектів кісток. № u 2020 06710: заявл. 19.10.2020; опубл. 17.02.2021, Бюл. № 7.
9. Європейська конвенція про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей. Страсбург, 18 березня 1986 року: офіційний переклад [Електронний ресурс] / Верховна Рада України. Офіц. веб-сайт. (Міжнародний документ Ради Європи). Режим доступу: http://zakon.rada.gov.ua/cgi-bin/laws/main.cginreg = 994_137.
10. Про захист тварин від жорстокого поводження: Закон України № 3447-IV вiд 21.02.2006, ст. 26, 31 [Електронний ресурс] / Верховна Рада України. Офіц. веб-сайт. Режим доступу: http://zakon.rada.gov.ua/cgi-bin/laws/main.cgi?nreg = 3447-15.
11. Наказ МОН, молоді та спорту України № 249 від 01.03.2012 «Порядок проведення науковими установами дослідів, експериментів на тваринах». Режим доступу: http://zakon3.rada.gov.ua/laws/show/z0416-12.
12. Авер’янова Л.О., Шармазанов С.А. Спеціалізовані програмні засоби для моніторингового дослідження стану кісткової системи населення. Радіотехніка: Всеукр. міжвід. наук.-техн. зб. 2001. Вип. 120. С. 206-209.
13. Тимошенко О.П., Карпинский М.Ю., Верецун А.Г. Исследование диагностических возможностей программного комплекса Х-rays. Медицина и... 2001. № 1. С. 62-64.
14. Головіна Я.О., Малик Р.В., Карпінський М.Ю., Карпінська О.Д. Дослідження рентгенологічної кісткової щільності у пацієнтів з кістковими пухлинами у разі застосування сегментарних кісткових алоімплантатів. Травма. 2022. Т. 23. № 1. С. 43-50. DOI: 10.22141/1608-1706.1.23.2022.881.
15. Бююль А., Цефлер П. SPSS: искусство обработки информации. Анализ статистических данных и восстановление скрытых закономерностей: Пер. с нем. СПб.: ДиаСофтЮП, 2005. 608 с.
16. Хвисюк О.М., Гонтар Н.М., Пастух В.В., Карпінський М.Ю., Карпінська О.Д. Експериментальне дослідження динаміки біодеградації матеріалу на основі полілактиду й трикальційфосфату після заповнення ним кісткових дефектів. Травма. 2022. 23(3). 58-62. https://doi.org/10.22141/1608-1706.3.23.2022.901.
/5.jpg)
/6_2.jpg)
/7.jpg)
/7_2.jpg)
/8.jpg)
/8_2.jpg)