Мобильная версия

Международный неврологический журнал Том 19, №4, 2023

Зміни числа макрофагів, Т-лімфоцитів, активності антиоксидантних ферментів у головному мозку, поведінки і структури нейронів центральної нервової системи у дорослих і старіючих мишей різних ліній із МФТП-індукованою моделлю паркінсонізму

Авторы: Лабунець І.Ф., Пантелеймонова Т.М., Утко Н.О., Кирик В.М., Савосько С.І., Літошенко З.Л.
Інститут генетичної та регенеративної медицини ДУ «Національний науковий центр «Інститут кардіології, клінічної та регенеративної медицини імені академіка М.Д. Стражеска НАМН України», м. Київ, Україна

Рубрики: Неврология

Разделы: Клинические исследования

Актуальність. Для розвитку морфофункціональних порушень нервової системи при хворобі Паркінсона (ХП) мають значення продукти окисного стресу і клітин імунної системи (Т-лімфоцити, макрофаги). Показано також зв’язок ХП із віком та функціонуванням генів головного комплексу гістосумісності. Мета: оцінити зміни вмісту в головному мозку Т-лімфоцитів, макрофагів, малонового діальдегіду (МДА), активності антиоксидантних ферментів, структури нейронів головного та спинного мозку, а також поведінки дорослих і старіючих мишей із різним гаплотипом за системою Н-2 з токсичною моделлю паркінсонізму. Матеріали та методи. Дорослим і старіючим мишам-самицям лінії FVB/N (генотип H-2q) і 129/Sv (генотип Н-2b) вводили нейротоксин 1-метил-4-феніл-1,2,3,6-тетрагідропіридин (МФТП) у дозі 30 мг/кг 1 раз. У головному мозку оцінювали вміст СD3+, СD3–CD11b+ і CD3+CD11b+ клітин, МДА та активність антиоксидантних ферментів; досліджували структуру нейронів чорної субстанції головного мозку, поперекового відділу спинного мозку та поведінку в тестах «відкрите поле», на ригідність і у ротарод-тесті (rotarod test). Результати. У дорослих мишей обох ліній під впливом МФТП порушується моторна і немоторна (орієнтовно-дослідницька, емоційна) активність; при цьому лінійні відмінності змін поведінки виявляються у їх напрямку та вираженості. У старіючих дослідних мишей лінії FVB/N переважають моторні порушення поведінки, які у мишей лінії 129/Sv поєднуються з немоторними змінами. Порушення структури нейронів чорної субстанції після введення МФТП більш виражене у мишей лінії FVB/N, а нейронів поперекового відділу спинного мозку — у мишей лінії 129/Sv. У старіючих дослідних мишей обох ліній відсоток ушкоджених нейронів у головному і спинному мозку суттєво менший, ніж у дорослих тварин. Після введення МФТП дорослим мишам спрямованість змін вмісту Т-лімфоцитів і макрофагів у головному мозку (підвищення або зниження) залежить від їх лінії. У старіючих дослідних мишей лінійна різноспрямованість змін зберігається для вмісту Т-лімфоцитів, тоді як уміст макрофагів зростає незалежно від лінії тварин. Під впливом МФТП уміст МДА зростає у головному мозку мишей усіх експериментальних груп; напрям змін активності супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази (зменшення або зростання) залежить від лінії тварин та їх віку. Висновки. МФТП-індуковані зміни (напрямки, вираженість) вмісту в головному мозку Т-лімфоцитів, макрофагів, активності антиоксидантних ферментів, структури нейронів чорної субстанції і поперекового відділу спинного мозку, а також поведінкових реакцій значною мірою залежать від гаплотипу дорослих мишей за системою Н-2. Існують вікові особливості впливу нейротоксину на зміни досліджуваних показників у мишей різних ліній; при цьому залежність змін більшості з них від H-2 гаплотипу зберігається.

Background. Oxidative stress and immune cell (T-lymphocytes, macrophages) products are important for the development of morpho-functional disorders of the nervous system in Parkinson’s disease. Connection of Parkinson’s disease with age and functioning of the major histocompatibility complex genes are also shown. The purpose was to assess changes in the brain of T-lymphocytes, macrophages, malondialdehyde (MDA) contents, the activity of antioxidant enzymes, the structure of brain and spinal cord neurons, as well as behavior in adult and aging mice with different H-2 haplotypes and toxic model of parkinsonism. Materials and methods. Adult and aging female mice of FVB/N (genotype H-2q) and 129/Sv (genotype H-2b) strains were once injected with the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) at the dose of 30 mg/kg. Contents of CD3+, CD3–CD11b+, CD3+CD11b+ cells, MDA and the activity of antioxidant enzymes in the brain were evaluated. The structure of neurons of the substantia nigra, lumbar spine, behavior in the open field test, as well as in rigidity and rotarod performance tests were studied. Results. In adult mice of both strains, motor and non-motor (spatial-exploratory, emotional) activity is impaired under the influence of MPTP. At the same time, linear differences in behavior changes were revealed in their directions and expressiveness. In aging FVB/N experimental mice, motor behavior disorders prevailed and were combined with non-motor changes in 129/Sv mice. Violations in the structure of substantia nigra neurons after MPTP administration were more severe in FVB/N mice while those in the lumbar spinal cord neurons were more pronounced in the 129/Sv mice. In aging experimental mice of both strains, the percentage of damaged neurons in the brain and spinal cord was significantly lower than in adult animals. After MPTP administration to adult mice, the direction of changes in the brain T-lymphocytes and macrophages (increase or decrease) depended on their strains. In aging experimental mice, the linear heterogeneity of changes was preserved for the T-lymphocyte content, while the macrophage level was increased regardless of the animal strains. Under MPTP influence, the MDA content increased in the brain of mice of all experimental groups. The direction of changes in superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and glutathione reductase activities (decrease or increase) depended on the strains of animals and their age. Conclusions. MPTP-induced changes (directions, expressiveness) in T-lymphocyte, macrophage contents, antioxidant enzymes activity, the structure of neurons of the substantia nigra and lumbar spine, as well as behavioral reactions largely depended on the adult mice H-2 haplotype. There were age-related effects of the neurotoxin on changes in the studied indicators in mice of different strains. At the same time, dependence of changes in most above indicators on the H-2 haplotype preserved.

Ключевые слова

нейротоксин МФТП; паркінсонізм; вік; Т-лімфоцити, макрофаги і антиоксидантні ферменти головного мозку; нейрони чорної субстанції та спинного мозку; поведінкові реакції

MPTP neurotoxin; parkinsonism; age; brain T-lymphocytes, macrophages and antioxidant enzymes; neurons of the substantia nigra and spinal cord; behavioral reactions

doi: http://dx.doi.org/10.22141/2224-0713.19.4.2023.1010

Вступ

Хвороба Паркінсона (ХП) є однією з найбільш поширених хронічних прогресуючих нейродегенеративних патологій, при якій розвиваються моторні, сенсорні, емоційні, вегетативні та когнітивні порушення [1]. Хоча ХП зустрічається переважно в осіб похилого і старечого віку, типовий вік маніфестації первинного паркінсонізму — після 40 років, тобто в період активного способу життя. Відомі випадки виявлення ХП у віковий період від 30 до 40 років.

Доведено, що при цій патології поява характерних моторних порушень пов’язана з масовою загибеллю дофамінергічних нейронів компактної частини чорної субстанції головного мозку. Разом з тим є дані щодо змін структури нейронів спинного мозку та їх значення для розвитку моторних порушень при ХП. Зокрема, показано, що при цій патології дегенеративні структурні зміни в спінальних нейронах пов’язані з акумуляцією токсичних білків (альфа-синуклеїн), розвитком реактивного гліозу з вираженою активацією мікроглії, зниженням активності мітохондріального комплексу IV в нейронах і гліоцитах, порушенням шляхів метаболізму глюкози, підвищенням експресії та активності таких білків, як кальпаїн, каспаза-3, p53 [2–4].

У патогенезі ХП важливе значення мають фактори окисного стресу і клітин імунної системи [5, 6]. Встановлено, що вільні радикали та активні форми кисню ушкоджують дофамінергічні нейрони чорної субстанції головного мозку на тлі зниження активності антиоксидантних ферментів [6–8]. Крім того, змінити структуру та функціонування нейронів центральної нервової системи (ЦНС) можуть продукти активації мікроглії/макрофагів (прозапальні цитокіни ІL-1β, TNF-α та вільні радикали) [9]. Виявлено також ушкоджуючий вплив Т-лімфоцитів на нейрони головного мозку при ХП. Ці клітини інфільтрують головний мозок і синтезують ТNF-α, ІFN-γ, ІL-1β, хемокіни, а також вивільняють активні форми кисню [9]. Разом з тим вікові особливості змін Т-лімфоцитів і макрофагів у головному мозку при ХП/паркінсонізмі залишаються недостатньо вивченими.

Становить інтерес дослідження у віковому аспекті значення генетичних факторів для розвитку ХП. Виявлено зв’язок поліморфізму специфічних генів, а також тих, які асоційовані з антиоксидантним захистом, антиапоптотичним ефектом, мітохондріальною дисфункцією із загибеллю нейронів у структурах ЦНС і підвищенням схильності до розвитку ХП [10]. Крім того, встановлено зв’язок між ризиком розвитку ХП і поліморфізмом генів головного комплексу гістосумісності (HLA), особливостями продукції деяких прозапальних цитокінів (TNF-α) і імуноглобулінів [11, 12].

Для вивчення механізмів розвитку нейродегенеративної патології за участі генетичних факторів використовують молодих або дорослих трансгенних і нокаутних тварин [13]. Крім того, перспективним модельним об’єктом у нейробіологічних дослідженнях можуть бути миші інбредних ліній, які відрізняються гаплотипом за системою Н-2 (аналог системи HLA людини) [14]. Такі миші характеризуються певними відмінностями у нейрохімічних, імуноендокринних, метаболічних показниках, реакції на дію регуляторних, стресових та ушкоджуючих факторів, а також в ефективності моделювання патологій нервової системи [15–17]. Оскільки показано вплив токсинів на підвищення ризику розвитку ХП у людини, є важливим відтворення її токсичних моделей на мишах із різним гаплотипом за системою Н-2 [18]. При цьому моделювання паркінсонізму на молодих/дорослих і старіючих мишах із різним гаплотипом Н-2 дозволить оцінити значення віку у впливі генетичних факторів на розвиток патології.

Мета: оцінити зміни вмісту в головному мозку Т-лімфоцитів, макрофагів, малонового діальдегіду (МДА), активності антиоксидантних ферментів, структури нейронів головного та спинного мозку, а також поведінки дорослих і старіючих мишей із різним гаплотипом за системою Н-2 з токсичною моделлю паркінсонізму.

Матеріали та методи

Тварини. Експерименти проводили на мишах-самицях лінії FVB/N (генотип H-2q, n = 72) і 129/Sv (генотип Н-2b, n = 72) віком 6–7 міс. (дорослі) та 15–17 міс. (старіючі) із розплідника Інституту генетичної та регенеративної медицини ДУ «Національний науковий центр «Інститут кардіології, клінічної та регенеративної медицини імені академіка М.Д. Стражеска НАМН України». Показано, що у таких мишей із різним гаплотипом за системою Н-2 є певні відмінності у функціонуванні імунної та ендокринної систем, поведінкових реакціях, темпах і механізмах старіння, типах вік-асоційованої патології, а також у розвитку адаптивних реакцій на дію деяких ушкоджуючих факторів, зокрема токсинів [15, 19]. У нашій роботі миші лінії FVB/N і 129/Sv обох вікових груп, які відрізнялись гаплотипом за системою Н-2, знаходилися у стандартних умовах віварію при фіксованому світловому режимі 12 : 12 і вільному доступі до їжі та води ad libitum.

Біологічний матеріал для дослідів отримували шляхом декапітації мишей у ранкові години доби під ефірним наркозом. Усі роботи виконували з дотриманням Закону України «Про захист тварин від жорстокого поводження», «Європейської конвенції із захисту хребетних тварин, які використовуються з експериментальною та іншою науковою метою» (Страсбург, 1986), а також за погодження з етичною комісією Інституту генетичної та регенеративної медицини.

Моделювання паркінсонізму. Для відтворення моделі паркінсонізму у мишей використовували нейротоксин 1-метил-4-феніл-1,2,3,6-тетрагідропіридин (МФТП), який після системного введення мишам ушкоджує дофамінергічні нейрони чорної субстанції середнього мозку та призводить до моторних порушень, які нагадують симптоми ХП у людини [18]. Відомо, що токсичний метаболіт МФТП (МФП+) структурно подібний до ендогенного нейротоксину N-метил-норсалсоліну, який виявляється у чорній субстанції пацієнтів із ХП.

У нашому експерименті МФТП (Sigma, США) вводили дорослим і старіючим мишам обох ліній підшкірно (у ділянку шиї) одноразово у дозі 30 мг/кг. Нами встановлено, що використання такої схеми введення нейротоксину дає можливість відтворити у мишей різного віку пізню стадію розвитку паркінсонізму, при якій спостерігається значне ушкодження дофамінергічних нейронів чорної субстанції головного мозку [20]. Контрольні групи дорослих і старіючих мишей обох ліній отримували розчинник МФТП (0,9% розчин хлориду натрію). Оцінку показників в експериментальних групах тварин проводили через 18 діб після одноразового введення відповідно МФТП або його розчинника.

Імунофенотипування клітин головного мозку за CD3, СD11b (Мас-1) маркерами проводили за допомогою моноклональних антитіл до мембранних антигенів миші, кон’югованих з флюорохромами (BD Bioscience, СШA): CD3-фікоеритрин-кон’юговані антитіла (кат. № 555275), CD11b-флуоресцеїнізоціонат-кон’юговані антитіла (кат. № 557396). Робоча концентрація моноклональних антитіл була 0,5 мкг/мл. У пробірки об’ємом 5 мл вносили 1 × 106 клітин гомогенату головного мозку в 50 мкл буферу для забарвлення (фосфатний буфер, який містить 0,1% азид натрію та 1% сироватку ембріонів корів) і надалі додавали моноклональні антитіла у розведенні 1 : 50. Проводили інкубацію впродовж 20 хв при температурі 4 °С, після чого клітини відмивали у буфері CellWash, центрифугували при 200 g упродовж 5 хв з підтриманням температури 4 °С. Безпосередньо перед аналізом суспензію клітин пропускали через клітинні фільтри з діаметром пор 70 мкм. Вимірювання проводили на лазерному проточному цитофлюориметрі-сортері BD FACSAria (Becton Dickinson, США) за допомогою програми BD FACS Diva 6.1.

Фактори окисного стресу та антиоксидантного захисту головного мозку. Уміст малонового діальдегіду (MДA) визначали в гомогенатах головного мозку за методом Uchiyama [21], з незначними модифікаціями. Принцип методу полягає у визначенні інтенсивності забарвлення, яке утворюється в ході реакції між MДA і тіобарбітуратною кислотою (ТБК), що відбувається у кислому середовищі при високій температурі. У результаті реакції утворюється триметиновий комплекс, який містить одну молекулу MДA і дві молекули ТБК і має характерний спектр поглинання з максимумом при довжині хвилі 535 нм. Уміст МДА вимірювали спектрофотометричним методом (спектрофотометр μQuant, Bio-Tek, США).

Активність антиоксидантних ферментів визначали у супернатантах гомогенатів головного мозку мишей спектрофотометричним методом (спектрофотометр μQuant, Bio-Tek, США) [20]. Для вимірювання активності супероксиддисмутази (СОД) використовували метод, заснований на здатності ферменту пригнічувати реакцію автоокиснення адреналіну (Fluka, Німеччина) в адренохром при рН 10,2. Активність СОД оцінювали в умовних одиницях із розрахунку на 1 мг білка за 1 хв. Активність каталази визначали з кінетики руйнування Н2О2 (Riedel-deHaën, Німеччина) і наводили в мікромолях утилізованої Н2О2 на 1 мг білка за 1 хвилину. Активність глутатіонпероксидази (ГП) і глутатіонредуктази (ГР) оцінювали за зменшенням NADPH (Sigma, США) у сполученій глутатіонредуктазній реакції з додаванням у реактивну суміш відповідних реагентів і виражали в наномолях окисненого NADPH на 1 мг білка за 1 хвилину. Уміст білка у головному мозку вимірювали за методом Лоурі.

Функціональий стан ЦНС визначали за показниками поведінки в тестах «відкрите поле», на ригідність, а також у ротарод-тесті (rotarod test) [20, 22]. Тест «відкрите поле» дозволяє оцінити у тварин: горизонтальну рухову активність (кількість перетнутих квадратів), орієнтовно-дослідницьку активність (кількість вертикальних стійок і заглядань у нірки — нірковий рефлекс), емоційну активність (кількість фекальних болюсів). Мишей усіх груп тестували впродовж 3 хв.

Ротарод-тест (тест із барабаном, що обертається) дає можливість досліджувати у мишей координацію, рівновагу та м’язовий тонус. Швидкість обертів змінювали в установці послідовно з 10 до 20 об/хв. Результати наводили у вигляді сумарного часу (секунда) утримання мишей на валу при 10 і 20 об/хв. Тривалість дослідження 10 хв.

Ригідність у мишей вивчали за довжиною тіла та кроку, а також за довжиною та шириною стопи (мм). Довжина кроку є одним із показників зміни ходи тварин, а її зменшення свідчить про порушення м’язової функції. Перед оцінкою ходи тварин їх стопи обробляли нетоксичними розчинами фарб різного кольору.

Морфологічні дослідження. Із головного мозку мишей виділяли середній мозок, а із спинного — поперековий відділ, які фіксували в 10%-му нейтральному формаліні [20, 23]. Після проведення зразків через спирти зростаючих концентрацій готували гістологічні зрізи компактної частини чорної субстанції та поперекового відділу спинного мозку товщиною 8–10 мкм, які надалі забарвлювали толуїдиновим синім за Ніслем. У 10 полях зору гістологічних препаратів підраховували частку структурно ушкоджених нейронів (клітини з ознаками цитолізу, гідропічної дистрофії, каріолізису, каріопікнозу). Мікрофотографії досліджуваних ділянок головного і спинного мозку отримували на мікроскопі Olympus BX 51 (Японія). Морфометричний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення Carl Zeiss software (AxioVision SE64 Rel.4.9.1).

Статистичний аналіз результатів проводили за допомогою критерію t Стьюдента. Різницю між показниками вважали вірогідною при значенні P < 0,05. Для статистичного аналізу отриманих результатів використовували програму Statistica 7.0 (StatSoft Inc., США).

Результати

Поведінка у мишей різних ліній та віку після введення МФТП. Нами встановлено, що після введення МФТП локомоторна активність і м’язовий тонус підвищились у дорослих мишей лінії FVB/N, тоді як у мишей лінії 129/Sv локомоторна активність (число квадратів і довжина кроку) суттєво зменшились, а м’язовий тонус залишався без змін порівняно з групою контролю. Орієнтовно-дослідницька активність зменшилась у дорослих дослідних мишей обох ліній, проте у мишей лінії 129/Sv вираженіше (табл. 1). Так, число стійок зменшилось у дослідних мишей ліній FVB/N і 129/Sv відповідно в 2,2 і 10 разів, а кількість заглядань у нірки — в 1,6 і 3,4 раза порівняно з групами контролю. Емоційна активність знизилась у дослідних мишей лінії FVB/N і не змінилась у мишей лінії 129/Sv.

У старіючих мишей лінії FVB/N, які отримували МФТП, горизонтальна локомоторна активність підвищилась, тоді як довжина тіла і кроку зменшилась порівняно з контрольною групою тварин. Число квадратів, стійок, зазирань у нірки і довжина кроку у старіючих дослідних мишей лінії 129/Sv були меншими, а час утримання на валу більшим, ніж у контрольній групі (табл. 1).

Отже, введення МФТП призводить до порушення поведінки у дорослих і старіючих мишей ліній FVB/N і 129/Sv. При цьому у дорослих дослідних мишей цих ліній спостерігаються моторні та немоторні зміни поведінкових реакцій, лінійні відмінності яких виявляються як у їх напрямку, так і вираженості. У старіючих мишей лінії FVB/N ефект МФТП проявлявся переважно в зміні рухової активності, тоді як у старіючих мишей лінії 129/Sv — моторної та немоторної активності.

Структура нейронів головного і спинного мозку мишей різних ліній та віку після введення МФТП. Нами раніше при відтворенні МФТП-моделі паркінсонізму на мишах різних ліній встановлено значне ушкодження нейронів чорної субстанції після введення нейротоксину в дозі 30 мг/кг [20]. У цьому дослідженні ми підтвердили отримані раніше результати: при морфометрії гістопрепаратів чорної субстанції головного мозку дорослих мишей ліній FVB/N і 129/Sv показане суттєве зростання числа ушкоджених нейронів після введення МФТП у тій же дозі (табл. 2). При цьому різниця показників у дослідних дорослих мишей ліній FVB/N і 129/Sv із групами контролю була 29 і 23 рази відповідно. У гістопрепаратах компактної частини чорної субстанції старіючих мишей ліній FVN/N і 129/Sv, що отримували МФТП, число ушкоджених нейронів перевищує значення цього показника в групах контролю, але менше порівняно з дослідними дорослими мишами (табл. 2).

Під впливом МФТП у поперековому відділі спинного мозку дорослих мишей ліній FVB/N і 129/Sv число ушкоджених нейронів суттєво зростає щодо групи контролю (табл. 2). При цьому відсоток ушкоджених нейронів у спинному мозку підвищується вираженіше у дослідних мишей лінії 129/Sv, ніж FVB/N. У старіючих мишей обох ліній після введення МФТП значення показника менше, ніж у дослідних дорослих мишей тих же ліній (табл. 2).

Отже, токсичний вплив МФТП на нейрони чорної субстанції головного мозку дорослих мишей більш виражений для лінії FVB/N, тоді як на нейрони поперекового відділу спинного мозку — для лінії 129/Sv. З віком міра ушкоджуючого ефекту нейротоксину на нейрони головного і спинного мозку зменшується у мишей обох ліній.

Вміст Т-лімфоцитів і макрофагів у головному мозку мишей різних ліній та віку після введення МФТП. Із даних табл. 3 видно, що у дорослих мишей контрольної групи лінії FVB/N частка СD3+ клітин у головному мозку більша, ніж у мишей лінії 129/Sv, тоді як частка CD3–CD11b+ і CD3+CD11b+ клітин менша. Під впливом МФТП вміст СD3+, CD3–CD11b+ і CD3+CD11b+ клітин підвищується в головному мозку мишей лінії FVB/N, і навпаки, значення цих показників зменшуються у мишей лінії 129/Sv.

З віком у головному мозку мишей контрольної групи лінії FVB/N зменшується частка Т-лімфоцитів і зростає частка макрофагів, тоді як у старіючих мишей лінії 129/Sv частка Т-клітин зростає і зменшується частка макрофагів (табл. 3). Тобто в головному мозку старіючих мишей лінії FVB/N баланс Т-лімфоцитів і макрофагів змінюється в бік останніх, тоді як у старіючих мишей лінії 129/Sv — Т-лімфоцитів. Після введення МФТП у мишей лінії FVB/N частка СD3+, CD3–CD11b+ і CD3+CD11b+ клітин зростає порівняно з групою контролю. У мишей лінії 129/Sv під впливом нейротоксину спостерігається зниження частки СD3+ клітин і зростання частки CD3–CD11b+ і CD3+CD11b+ клітин. При цьому зростання частки CD3–CD11b+ клітин у дослідних мишей ліній FVN/N і 129/Sv спостерігається у 4,4 і 1,6 раза, а частки CD3+CD11b+ клітин — у 2 і 1,5 раза відповідно.

Отже, у головному мозку як дорослих, так і старіючих мишей контрольних груп ліній FVN/N і 129/Sv існують відмінності в балансі вмісту Т-лімфоцитів і макрофагів. Виявлено лінійні особливості реакції Т-лімфоцитів і макрофагів на введення нейротоксину МФТП. Так, у дослідних дорослих мишей ліній FVN/N і 129/Sv зміни вмісту цих клітин різноспрямовані. Для старіючих дослідних мишей цих ліній аналогічна різноспрямованість зберігається для вмісту Т-лімфоцитів. Щодо макрофагів, то їх вміст зростає під впливом МФТП незалежно від лінії мишей, проте зміни значень показника більш виражені у дослідних мишей лінії FVN/N.

Вплив нейротоксину МФТП на показники окисного стресу та антиоксидантного захисту головного мозку мишей різного віку та ліній. Нами раніше встановлено, що під впливом МФТП у головному мозку мишей різних ліній та віку змінюється баланс між факторами окисного стресу і антиоксидантного захисту [20]. У цій роботі ми підтвердили отримані раніше результати і показали, що після введення МФТП вміст МДА у головному мозку мишей ліній FVB/N і 129/Sv обох вікових груп зростає. У контрольній групі дорослих мишей лінії FVB/N активність каталази в головному мозку вища, тоді як активність ГП і ГР менша, ніж у мишей лінії 129/Sv (табл. 4). Після введення МФТП спостерігається зниження активності каталази і ГР у головному мозку дорослих мишей лінії FVB/N і, навпаки, підвищення активності СОД, ГП, ГР у мишей лінії 129/Sv щодо групи контролю.

З віком спостерігається зменшення активності ГР у головному мозку старіючих мишей обох ліній конт-рольної групи, а також зниження активності каталази в головному мозку старіючих мишей лінії FVB/N (табл. 4). Після введення МФТП активність каталази і ГР у головному мозку старіючих мишей лінії FVB/N підвищується, тоді як у старіючих дослідних мишей лінії 129/Sv спостерігається зниження активності каталази і зростання активності ГР.

Тобто після введення МФТП у головному мозку мишей ліній FVB/N і 129/Sv обох вікових груп змінюється вміст МДА та активність деяких антиоксидантних ферментів. При цьому на спрямованість змін показників у дослідних мишей впливає їх вік та лінія.

Таким чином, нами встановлено, що МФТП-інду-ковані зміни вмісту Т-лімфоцитів, макрофагів, МДА та активності антиоксидантних ферментів у головному мозку, структури нейронів чорної субстанції і поперекового відділу спинного мозку, а також поведінки мишей значною мірою залежать від їх гаплотипу за системою Н-2 та мають вікові особливості.

Обговорення

Вплив нейротоксину МФТП на морфофункціональні зміни ЦНС, вміст імунних клітин та стан антиоксидантного захисту головного мозку дорослих мишей різних ліній. Оскільки на сьогодні ХП діагностують не тільки в похилому, але й у більш молодому віці, ми моделювали паркінсонізм у дорослих мишей (віком 6–7 міс.) різних ліній. Було підтверджено встановлений нами раніше факт щодо значних порушень рухової функції у дорослих мишей-самиць ліній FVB/N і 129/Sv після одноразового введення МФТП у дозі 30 мг/кг, що спостерігалось на тлі значного ушкодження структури нейронів чорної субстанції головного мозку [20]. При цьому посилення горизонтальної локомоторної активності у дослідних мишей лінії FVB/N може бути пов’язане з тимчасовим підвищенням вмісту позаклітинного дофаміну в середньому мозку (перед його подальшим зниженням) [24]. У мишей лінії 129/Sv після введення МФТП рухова активність суттєво пригнічувалась.

Відомо, що кора головного мозку, стовбур мозку, мозочок, базальні ганглії та мотонейрони спинного мозку в результаті своїх взаємодій впливають на позу та рух тварин. Дійсно, нами встановлено, що у мишей ліній FVB/N і 129/Sv під впливом МФТП розвиваються структурні зміни мотонейронів поперекового відділу спинного мозку, що свідчить про їх внесок у розвиток моторних порушень. При цьому у мишей лінії 129/Sv ушкодження нейронів спинного мозку більш виражене, ніж у мишей лінії FVB/N, і збігається з менш значним ушкодженням нейронів чорної субстанції у таких тварин. Подібну картину ми спостерігали у дорослих щурів із різними стадіями паркінсонізму, у яких виражені зміни рухової активності спостерігались на тлі значних порушень структури мотонейронів спинного мозку і незначних змін структури нейронів чорної субстанції [25]. Тобто дегенеративні зміни у спинному мозку є важливими для порушень моторної активності тварин на різних стадіях паркінсонізму.

Крім того, виявлені нами зміни емоційної та дослідницької активності після введення МФТП мишам ліній FVB/N і 129/Sv, скоріше за все, розвиваються в результаті ушкоджуючого впливу нейротоксину на структури головного мозку, що їх регулюють [6, 26]. Так, церебральна кора разом зі структурами лімбічної системи і гіпоталамусом забезпечує нервову регуляцію емоційних проявів поведінкових реакцій.

Викликає інтерес встановлений нами факт особливостей змін деяких показників поведінки у мишей різних ліній після ін’єкції МФТП. Відмінності поведінки у мишей різних ліній автори пояснюють генетичними особливостями пластичності синапсів структур головного мозку, які відповідають за навчання, пам’ять і рух, а також метаболізму в них нейротрансмітерів і фосфоліпідів [27, 28]. Крім того, відмінності у поведінці мишей різних ліній можна пояснити їх різною чутливістю до дії нейротоксину, що обумовлено особливостями активності моноаміноксидази В головного мозку, різними темпами метаболізму нейротоксичних засобів в організмі, а також різницею у толерантності до окисного стресу [29, 30].

Відомо, що одним із факторів окисного стресу, який ушкоджує нейрони чорної субстанції як у пацієнтів із ХП, так і у мишей із МФТП-моделлю паркінсонізму, є МДА [6, 8]. Він утворюється в результаті пероксидації поліненасичених жирних кислот і здатний вступати в реакцію з нуклеїновими кислотами, фосфоліпідами та амінокислотами. Нами встановлено, що під впливом МФТП вміст МДА у головному мозку дорослих мишей лінії FVB/N зростає, що збігається зі зниженням активності каталази і ГР. Водночас підвищення активності СОД, ГР і ГП у головному мозку дослідних мишей лінії 129/Sv спостерігається на тлі відсутності змін вмісту МДА. Особливості змін активності антиоксидантних ферментів у мишей різних ліній після введення МФТП можуть віддзеркалювати особливості стану антиоксидантного захисту головного мозку. Так, за нашими даними, для дорослих мишей лінії 129/Sv характерна більш висока, ніж у мишей лінії FVB/N, активність деяких антиоксидантних ферментів у головному мозку, що сприяє зниженню вмісту МДА ще в ранні терміни дії МФТП [31]. Треба зазначити, що при нейродегенеративній патології в головному мозку, окрім МДА, суттєво зростає вміст ROS (Reactive Oxygen Species), які також ушкоджують структуру нейронів ЦНС. Тому ми не виключаємо того, що у мишей лінії 129/Sv висока активність антиоксидантних ферментів сприяє зменшенню вмісту ROS у головному мозку.

Крім факторів окисного стресу, токсичний вплив МФТП на нейрони чорної субстанції та інших структур головного мозку може бути опосередкований прозапальними цитокінами (ТNF-α, ІFN-γ, ІL-1β), які синтезує активована мікроглія [9, 30]. При ХП джерелом таких цитокінів можуть бути також Т-лімфоцити (Т-хелпери і Т-супресори), які інфільтрують головний мозок і, зокрема, знайдені в чорній субстанції [9, 30]. Ушкоджуючий ефект МФТП на дофамінергічні ней-рони чорної субстанції значно слабшає у мишей із відсутністю зрілих Т-клітин. В експерименті показано зв’язок активованої мікроглії та Т-лімфоцитів при паркінсонізмі [9]. Зокрема, встановлено активуючий вплив цитокінів, що синтезують клітини активованої мікроглії/макрофаги, на міграцію Т-лімфоцитів із периферії у головний мозок. Нами показано, що після введення МФТП підвищення числа активованих макрофагів у головному мозку мишей лінії FVB/N збігається зі зростанням в ньому частки Т-лімфоцитів. Мабуть тому ми спостерігали більш виражене порушення структури нейронів чорної субстанції у дослідних мишей лінії FVB/N порівняно з мишами лінії 129/Sv. Авторами доведено, що для формування особливостей морфофункціональних змін ЦНС під впливом МФТП мають значення лінійні відмінності у стані базальної секреції деяких цитокінів [32].

Вплив нейротоксину МФТП на морфофункціональні зміни ЦНС, вміст імунних клітин та стан антиоксидантного захисту головного мозку старіючих мишей різних ліній. Нами встановлено, що токсичний ефект МФТП на структуру нейронів чорної субстанції і мотонейронів спинного мозку старіючих мишей ліній FVB/N і 129/Sv менш значний, ніж у дорослих мишей. Зниження при старінні чутливості нервових клітин до дії нейротоксинів, зокрема МФТП, може бути результатом розвитку в головному мозку окисного стресу, посилення продукції прозапальних цитокінів, а також його інфільтрації Т-лімфоцитами і макрофагами [33, 34]. Мають також значення вікові зміни темпів метаболізму нейротоксичних засобів в організмів тварин [29]. Крім того, дослідженнями авторів [35] показано менш виражене зниження концентрації дофаміну в стріатумі старіючих тварин після введення МФТП порівняно з молодими тваринами.

Нами встановлено значні зміни рухової активності старіючих мишей обох ліній після введення МФТП на тлі менш вираженого, ніж у дорослих мишей, ушкодження структури нейронів головного і спинного мозку. Відомо, що при старінні змінюються шляхи впливу не тільки регуляторних, але й токсичних чинників на ЦНС [33, 34]. Тому можна припустити, що в розвитку порушень рухової активності у старіючих мишей під впливом МФТП можуть брати участь інші структури головного мозку (моторна кора, мозочок тощо) [26, 36]. Крім того, авторами показано, що пролонгована активація клітин мікроглії і макроглії головного мозку старіючого організму за умов дії нейротоксинів має велике значення для розвитку ушкоджень нервових клітин [34]. Нами встановлено суттєве зростання під впливом нейротоксину вмісту макрофагів у головному мозку старіючих мишей обох ліній, яке перевищувало значення показника у дорослих тварин.

Ще одним ушкоджуючим чинником для клітин чорної субстанції та інших структур головного мозку старіючих мишей може бути МДА, вміст якого суттєво зростає після введення МФТП. При цьому посилення активності деяких антиоксидантних ферментів у головному мозку дослідних старіючих мишей, на відміну від дорослих, може віддзеркалювати вікові зміни їх реакції на дію чинників окисного стресу за умов введення МФТП. Подібний характер відстроченої активації антиоксидантних ферментів у головному мозку старіючих мишей ми спостерігали у відповідь на введення нейротоксину купризону [37].

Висновки

1. У дорослих мишей із МФТП-моделлю паркінсонізму зміни (напрямки, вираженість) вмісту в головному мозку Т-лімфоцитів, макрофагів, активності антиоксидантних ферментів, структури нейронів чорної субстанції та поперекового відділу спинного мозку, а також поведінкових реакцій значною мірою залежать від їх гаплотипу за системою Н-2.

2. Існують вікові особливості впливу нейротоксину МФТП на зміни вмісту Т-лімфоцитів, макрофагів, активності антиоксидантних ферментів у головному мозку, структури нейронів ЦНС і поведінки мишей обох ліній. При цьому залежність змін більшості з досліджених показників від H-2 гаплотипу зберігається.

3. Запропонований підхід з відтворення токсичної моделі паркінсонізму на мишах із різним гаплотипом за системою Н-2, яка є аналогом HLA людини, може бути моделлю для вивчення ролі генетичних факторів у механізмах розвитку цієї патології за участі клітин імунної системи і факторів антиоксидантного захисту головного мозку. Встановлення відмінностей функціонування ЦНС у дослідних мишей із різним гаплотипом за системою Н-2 дозволить прогнозувати особливості реакції організму при нейродегенеративній патології за генетичною характеристикою індивідуума, а також може бути підґрунтям при розробці індивідуалізованих підходів до терапії паркінсонізму.

Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів та власної фінансової зацікавленості при підготовці даної статті.

Інформація про фінансування. Дослідження проведені за бюджетною темою № 0121U111586 при фінансовій підтримці НАМНУ.

Отримано/Received 18.06.2023

Рецензовано/Revised 07.07.2023

Прийнято до друку/Accepted 14.07.2023

Список литературы

1. Карабань І.М. Сучасні аспекти діагностики та медикаментозної терапії хвороби Паркінсона. Журнал неврології ім. І.М. Маньковського. 2015. Т. 3. № 1. С. 50-57.

2. Knaryan V.N., Samantaray S., Gal C. et al. Tracking extranigral degeneration in animal models of Parkinson’s disease: Quest for effective therapeutic strategies. J. Neurochem. 2011. Vol. 118. № 3. P. 326-338. DOI: 10.1111/j.1471-4159.2011.07320.x.

3. Samantarray S., Knaryan V.N., Shields D.C. Critical role of calpain in spinal cord degeneration in Parkinson’s disease. JNC. 2013. Vol. 127. P. 880-890. DOI: 10.1111/jnc.12374.

4. Jingjing J., Lei S., Zhifeng L. Critical role of calpain in inflammation. Biomed. Rep. 2016. Vol. 5. № 6. Р. 647-652. DOI: 10.3892/br.2016.785.

5. Gonzalez H. T-cell-mediated regulation of neuroinflammation involved in neurodegenerative diseases. J. Neuroinflammation. 2014. Vol. 11. № 201. Р. 11. DOI: 10.1186/s12974-014-0201-8.

6. Guo J.-D., Zhao X., Li Y., Li G.-R., Liu X-L. Damage to dopaminergic neurons by oxidative stress in Parkinson’s disease (Review). Int. J. of Molecular Medicine. 2018. Vol. 41. P. 1817-1825. doi: 10.3892/ijmm.2018.3406.

7. Labunets I.F., Talanov S.A., Vasilyev R.G. et al. Thymic hormones, antioxidant enzymes and neurogenesis in bulbus olfactorius of rats with hemiparkinsonism: effect of melatonin. Int. J. Phys. Pathophys. 2016. Vol. 7. № 4. P. 285-298. DOI: 10.1615/IntJPhysPathophys.v7.i4.10.

8. Hwang O. Role of oxidative stress in Parkinson’s disease. Exp. Neurobiol. 2013. Vol. 22. № 1. P. 11-17. doi: 10.5607/en.2013.22.1.11.

9. Appel S.H., Beers D.R., Henkel J.S. The T cell-microglial dialogue in Parkinson’s disease and amyotrophic lateral sclerosis: are we listening? Trends Immunol. 2010. Vol. 31. № 1. Р. 7-17. DOI: 10.1016/j.it.2009.09.003.

10. Simon D.K., Tanner С.M., Brundin P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics and pathophysiology. Clin. Geriatr. 2020. Vol. 36. № 1. P. 1-12. Doi: 10.1016/j.cger.2019.08.002.

11. Kannarkat G.T., Cook D.A., Lee J.K. et al. Common genetic variant association with altered HLA expression synergy with pyrethroid exposure, and risk for Parkinson’s disease: an observational and case control study. Parkinson’s disease. 2015. Vol. 1. Р. 15002. DOI: 10.1038/npjparkd.2015.2.

12. Yue H., Han W., Sheng L. Associated of proinflammatory cytokines gene polymorphisms with Alzheimer’s disease susceptibility in the Han Chinese population. Int. J. Clin. Exp. Med. 2017. Vol. 10. № 3. P. 5422-5428.

13. Dawson T.M., Golde T.E., Lagier-Tourenne C.L. Animal models of neurodegenerative diseases. Nat. Neurosci. 2018. Vol. 21. № 10. P. 1370-1379. doi: 10.1038/s41593-018-0236-8.

14. Fisher E.M., Bannerman D.M. Mouse models of neurodegeneration: know your question, know your mice. Sci. Transl. Med. 2019. Vol. 11. DOI: 10.1126/scitranslmed.aaq1818.

15. Qosa H., Kaddoumi А. Effect of mouse strain as a background for Alzheimer’s disease models on the clearance of amiloid-β. J. Syst. Integr. Neurisci. 2016. Vol. 2. № 2. P. 135-140. doi: 10.15761/JSIN.1000123.

16. Seeger D.R., Murphy E.J. Mouse strain impacts fatty acid uptake and trafficking in liver, heart and brain: a comparison of C57BL/6 and Swiss Webster mice. Lipids. 2016. Vol. 51. № 5. P. 549-560. DOI: 10.1007/s11745-015-4117-6.

17. Matsio K., Watanabe Т., Takenaka А. Effect of dietary vitamin E on oxidative stress-related gene-midiated differences in anxiety-like behavior in inbred strains of mice. Physiology & Behavior. 2019. Vol. 207. P. 64-72. DOI: 10.1016/j.physbeh.2019.04.026.

18. Zhang X.S., Geng W.S., Jia J.J. Neurotoxin-induced animal models of Parkinson disease: pathogenic mechanism and assessment. ASN Neuro. 2018. Vol. 10. № 1. DOI: 10.1177/1759091418777438.

19. Eltokhi A., Kurpiers В., Pitzer С. Behavioral tests assessing neuropsychiatric phenotypes in adolescent mice reveal strain- and sex specific effects. Scientific Receptors. 2020. Vol. 10. № 11263. DOI: 10.1038/s41598-020-67758-0.

20. Labunets I.F., Utko N.A., Savosko S.I. et al. Changes in nigral neuronal structure, indices of antioxidant protection of the brain and behavior in mice of different age with MPTP parkinsonism model. International Neurological Journal. 2020. Vol. 16. № 3. P. 7-15. DOI: 10.22141/2224-0713.16.3.2020.203444].

21. Uchiyama M., Mihara M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal. Biochem. 1978. Vol. 86. № 1. P. 271-278. DOI: 10.1016/0003-2697(78)90342-1.

22. Fernagut P.O., Diguet E., Labattu B., Tison F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostrial dysfunction in mice. J. Neurosci. Methods. 2002. Vol. 113. № 2. Р. 123-130. DOI: 10.1016/s0165-0270(01)00485-x.

23. Lu W., Li J.P., Jiang Z.D. et al. Effects of targeted muscle reinnervation on spinal cord motor neurons in rats following tibial nerve transection. Neural. Regen. Res. 2022. Vol. 17. Р. 1827-1832. DOI: 10.4103/1673-5374.332156.

24. Torres E.R., Akinyeke T., Stagaman K. et al. Effects of sub-chronic MPTP exposure on behavioral and cognitive performance and the microbiome of wild-type and mGlu8 knockout female and male mice. Front. Behav. Neurosci. 2018. Vol. 12. Article 140. DOI: 10.3389/fnbeh.2018.00140.

25. Labunets I.F., Chaikovsky Y.B., Savosko S.I. et al. Effects of melatonin on the behavioral indices and structural characteristics of cerebral and spinal neurons of rats with experimental hemiparkinsonism. Neurophysiology. 2018. Vol. 50. № 1. P. 11-22. DOI: 0090-2977/18/5001-0011.

26. Mathai A., Ma Y., Pare J.-F. et al. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 2015. Vol. 138. P. 946-952. DOI: 10.1093/brain/awv018.

27. Nguyen P.V. Comparative plasticity of brain synapses in inbred mouse strains. J. Exp. Biol. 2006. Vol. 209. P. 2293-2303. Doi: 10.1242/jeb.01985.

28. Pick Ch.G., Yanai J. Studied into the mechanisms of strain differences in hypocampus-related behaviors. Behav. Genet. 1989. Vol. 19. № 2. P. 315-325. Doi: 10.1007/BF01065913.

29. Jackson-Lewis V., Przedborski S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson’s disease. Nature Protocols. 2007. Vol. 2. № 1. P. 141-151. DOI: 10.1038/nprot.2006.342.

30. Meredith G.E., Rademacher D.J. MPTP mouse models of Parkinson’s disease: an update. J. Parkinsons Dis. 2011. Vol. 1. № 1. P. 19-33. DOI: 10.3233/JPD-2011-11023.

31. Labunets I.F. Behavioral features in the mice of various strains and sex with model of parkinsonism. Fiziol. Zh. 2020. Vol. 66. № 1. Р. 18-24. DOI: https://doi.org/10.15407/fz.

32. Szade A., Nowak W.N., Szade K. et al. Effect of cros-sing C57Bl/6 and FVB mouse strains on basal cytokine expression. Mediators inflammation. 2015. Article ID762419. Doi: 10.1155/2015/762419.

33. Labunets I.F. Changes of thymic endocrine function, brain macrophages and T-lymphocytes in mice of different ages after administration of neurotoxin cuprizone and cytokine. International Neurogical Journal. 2018. № 4 (98). Р. 114-120. DOI: 10.22141/2224-0713.4.98.2018.139434.

34. Freitas H.R., Ferreira G.D.C., Trevenzoli I.H., Oliveira K.J., de Melo Reis R.A. Fatty acids, amtioxidants and physical activity in brain aging. Nutrients. 2017. Vol. 9. № 11. pii: E.1263. doi: 10.3390/nu9111263.

35. Huang D., Xu J., Wang J. et al. Dynamic changes in the nigrostrial pathway in the MPTP mouse model of Parinson’s di–sease. Parkinson disease. 2017. Article ID 9349487. 7 p. https://doi.org/10.1155/2017/9349487.

36. Guo L., Xiong H., Kim J.-I. et al. Dynamic re-wiring of neural circuits in the motor cortex in mouse models of Parkinson’s diseasel. Nat. Neurosci. 2015. Vol. 18. № 9. P. 1299-1309. doi: 10.1038/nn.4082.

37. Labunets I.F. Possibilities and prospects of the application of the in vivo and in vitro toxic cuprizone model for demyelination in experimental and clinical neurology (literature review and own research results). Ukrai'ns'kiy nevrologichniy zhurnal. Ukrainian Neurological Journal. 2018. № 2. P. 63-68. https://doi.org/10.30978/UNZ2018263.