Международный эндокринологический журнал Том 19, №6, 2023

Зміни кишкової мікробіоти у пацієнтів з метаболічно-асоційованим стеатозом печінки

Авторы: Комариця О.Й., Радченко О.М., Москва Х.А., Боровець М.О.
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, м. Львів, Україна

Рубрики: Эндокринология

Разделы: Клинические исследования

Актуальність. Сучасна наука розглядає зміни кишкової мікробіоти як патогенетичну ланку розвитку багатьох хвороб, зокрема метаболічно-асоційованої жирової хвороби печінки та стеатозу печінки (МАСП). Хоча дисбіоз є на кожній стадії розвитку жирової хвороби печінки, дотепер точно не встановлені типові ознаки окремо для МАСП, що зумовлює актуальність та доцільність нашого дослідження. Мета дослідження: охарактеризувати стан кишкової мікробіоти у пацієнтів з МАСП. Матеріали та методи. Обстежено 19 пацієнтів, з них 14 амбулаторних пацієнтів з метаболічним синдромом та МАСП і 5 пацієнтів без метаболічного синдрому з інтактною печінкою, які істотно відрізнялись лише за індексом маси тіла, з аналогічними гендерно-віковим розподілом, артеріальним тиском, параметрами ліпідного та вуглеводного метаболізму. Крім стандартних клініко-лабораторних обстежень, пацієнтам проведений метагеномний аналіз мікробіому кишечника методом полімеразно-ланцюгової реакції у сертифікований лабораторії. Пацієнти лікувались та обстежувались відповідно до нормативних документів та Гельсінської декларації прав людини. Цифрові результати опрацьовано статистично, рівень вірогідності р < 0,05. Результати. Зміни мікробіому кишечника у пацієнтів з жировою хворобою печінки починалися вже на стадії стеатозу та проявлялися збільшенням загальної бактеріальної маси на третину, нижчою кількістю облігатних штамів (Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacteroides thetaiotaomicron, Akkemansia muciniphila) та збільшенням умісту умовно-патогенних штамів (Сlostridium perfringens, Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli enterоpathogenic, Shigella, Proteus, Salmonella) порівняно з пацієнтами з інтактною печінкою. Основну масу бактеріальних ДНК становили ДНК Bacteroidetes (50,66 %; порівняно з інтактною печінкою Δ = +8,29 %) та Firmicuts (31,97 ± 3,19 %; Δ = –10,87 %), тоді як 7,47 ± 2,69 % становили ДНК Actinobacteria (Δ = +40,41 %). Зміни метагеномного стану мікробіому кишечника пов’язані з масою тіла, системною гемоциркуляцією та ліпідним і вуглеводним метаболізмом. Висновки. За умов жирової хвороби печінки вже на стадії стеатозу спостерігався кишковий дисбіоз зі збільшенням загальної бактеріальної маси, нижчою кількістю облігатних та збільшенням умовно-патогенних штамів, що через метаболічні впливи може зумовлювати прогресування хвороби печінки.

Background. Modern science considers changes in the gut microbiota as a pathogenetic factor in the development of many diseases, including metabolic-associated fatty liver disease (MAFLD) and liver steatosis. Although dysbiosis is present at every stage of fatty liver disease, typical signs have not been identified separately for MAFLD that determines the relevance and expediency of our research. This investigation purposed to evaluate the state of the gut microbiota in patients with MAFLD. Materials and methods. In total, 19 patients were observed. Among them, 14 had metabolic syndrome and MAFLD and 5 were without metabolic syndrome with intact liver. These two groups differed significantly only in body mass index, had similar gender-age distribution, blood pressure, parameters of lipid and carbohydrate metabolism. Metagenomic analysis of the intestinal microbiome was performed by polymerase chain reaction in a certified laboratory in addition to standard clinical and laboratory examinations. Patients were treated and examined according to regulatory documents and the Declaration of Helsinki. Digital results were processed statistically, the level of significance was p < 0.05. Results. In patients with MAFLD, the changes in the gut microbiota began already at the stage of steatosis. They manifested by an increase in the total bacterial mass by a third, a lower number of obligate strains (Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacteroides thetaiotaomicron, Akkermansia muciniphila) and an increased content of opportunistic pathogens (Сlostridium perfringens, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, enterоpathogenic Escherichia coli, Shigella, Proteus, Salmonella) in contrast to patients with an intact liver. The bulk of bacterial DNA were DNA of Bacteroidetes (50.66 % compared to intact liver; Δ = +8.29 %) and Firmicutes (31.97 ± 3.19 %; Δ = –10.87 %) and Actinobacteria DNA (Δ = +40.41 %) made up 7.47 ± 2.69 %. Changes in the metagenomic status of the gut microbiota are associated with body weight, systemic blood circulation, lipid and carbohydrate metabolism. Conclusions. Alterations in the gut microbiota with an increase in total bacterial mass, a lower number of obligate and increased amount of opportunistic strains already at the stage of steatosis have been shown to correlate with the development and progression of fatty liver disease due to metabolic effects.

Ключевые слова

метаболічно-асоційований стеатоз печінки; дисбіоз; метагеномний стан мікробіому кишечника; облігатні штами; умовно-патогенні штами

metabolic-associated fatty liver disease; dysbiosis; metagenomic status of the intestinal microbiota; obligate strains; opportunistic strains

doi: http://dx.doi.org/10.22141/2224-0721.19.6.2023.1309

Вступ

Сучасна наука розглядає зміни кишкової мікробіоти як патогенетичну ланку розвитку багатьох хвороб, зокрема метаболічно-асоційованої жирової хвороби печінки (МАЖХП) [1] та стеатозу печінки (МАСП). Експериментальні дослідження показали, що розвиток МАЖХП детермінований бактеріями кишки [2], тоді як підвищення фізичної активності та зміна способу життя поліпшували стан печінки саме через кишкову мікробіоту [3]. Зміни складу бактерій кишок виявлені у пацієнтів з МАСП, а застосування пробіотиків, пребіотиків чи синбіотиків поліпшувало фенотип пацієнтів з МАЖХП [2].

Якісні зміни бактеріального спектра у пацієнтів з МАЖХП різноманітні. Так, описано збільшення кількості штамів Roseburia, Streptococcus, Rothia [4, 5], за іншими даними, зростає вміст Clostridium, Anaerobacter, Escherichia та Lactobacillus, тоді як кількість Oscillibacter, Flavonifaractor, Odoribacter, Alistipes spp. зменшується [6]. Порівняно зі здоровими особами у пацієнтів зі стеатогепатитом вияв–лялась більша кількість Proteobacteria, Enterobacteriaceae та Escherichia spp., тоді як Faecalibacterium prausnitzii та Akkermansia muciniphila були у меншій кількості [6].

Описані патогенетичні ланки впливу мікробіоти: 1) дисбіозіндукована дисрегуляція ендотеліальної бар’єрної функції, що збільшує проникність для бактерій та призводить до запалення у печінці; 2) збільшення абсорбції вироблених бактеріями продуктів життєдіяльності (вільні жирні кислоти, ліпополісахариди, жовчні кислоти, холін, триметиламін-N-оксид, амоній, етанол та прозапальні цитокіни) робить печінку вразливою для розвитку жирового гепатозу [1, 2, 6, 7]. Експериментальні дослідження показали зміни сигнального шляху Toll-like-рецепторів унаслідок впливу бактеріальних ліпополісахаридів [5].

Механізми впливу мікробіоти на ланцюг жирового ураження печінки (МАСП — стеатогепатит — цироз печінки — гепатоцелюлярна карцинома) дотепер точно не встановлені [5], хоча дослідники вважають, що мікробіота впливає на прогресування МАЖХП незалежно від маси тіла [1]. Хоча дисбіоз є на кожній стадії розвитку ланцюга МАЖХП, точно не встановлені типові ознаки окремо для МАСП чи стеатогепатиту [6], що зумовлює актуальність та доцільність нашого дослідження.

Мета дослідження: охарактеризувати стан кишкової мікробіоти у пацієнтів з МАСП.

Матеріали та методи

Обстежено 14 амбулаторних пацієнтів з метаболічним синдромом (МС), зокрема порушенням толерантності до глюкози чи цукровим діабетом 2-го типу (ЦД2), артеріальною гіпертензією I ст., надмірною масою тіла чи ожирінням, МАСП. Усі пацієнти отримували антигіпертензивне та антигіперглікемізуюче лікування. Контролем слугували 5 пацієнтів без МС з інтактною печінкою, які істотно відрізнялися лише за індексом маси тіла (ІМТ) (табл. 1).

Крім стандартних клініко-лабораторних обстежень, пацієнтам проведений метагеномний аналіз мікробіому кишечника методом полімеразно-ланцюгової реакції у сертифікованій лабораторії DIAGEN. Пацієнти лікувались та обстежувались відповідно до нормативних документів та Гельсінської декларації прав людини. Цифрові результати опрацьовано статистично, рівень вірогідності р < 0,05.

Результати

Пацієнти з МАСП відрізнялись більшою загальною бактеріальною масою, що перевищувала норму (< 1012 КУО/см3) і на третину перевищувала значення групи інтактної печінки (+33,70 %) (2,14 ± 0,95 проти 1,60 ± 0,97 КУО/см3, р > 0,05). Відносна структура бактеріальної ДНК наведена на рис. 1, де показано, що основну масу бактеріальних ДНК становили ДНК Bacteroidetes (50,66 ± 3,51 %) та Firmicuts (31,97 ± 3,19 %), тоді як 7,47 ± 2,69 % становили ДНК Actinobacteria, а 12,48 ± 1,56 % — інші групи (рис. 1). Дисбактеріоз знайшов відображення у суттєвому зменшенні відношення Firmicuts/Bacteroidetes (F/B ratio; норма 1,0–5,0) (0,74 ± 0,13), тоді як у пацієнтів з інтактною печінкою воно практично було на рівні нижньої межі норми (0,95 ± 0,31). За рівнем відношення Вacteroides fragilis group/Faecalibacterium prausnitzii (норма до 100,0) за умов МАСП спостерігалась явна перевага групи Вacteroides fragilis (1175,02 ± 936,63), це відношення було нормальним лише у 28,57 %, тоді як у групі контролю — у 60,00 %.

Порівняно з пацієнтами з інтактною печінкою спостерігалось збільшення кількості Bacteroidetes (+8,29 %), Actinobacteria (+40,41 %) та інших штамів (+3,83 %), тоді як кількість Firmicuts була нижчою (–10,87 %) (рис. 2).

За абсолютною та відносною кількістю окремих штамів бактерій істотних відмінностей між пацієнтами з МАСП та інтактною печінкою не було виявлено (крім Staphylococcus aureus, кількість яких за умов МАСП була вірогідно більшою, табл. 2), хоча певні особливості кишкової мікробіоти у пацієнтів з МАСП можна виокремити. З облігатних представників у пацієнтів з МАСП порівняно з нормою була нижчою кількість Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacteroides thetaiotaomicron, Akkemansia muciniphila, а вміст Escherichia coli дещо перевищував норму. З умовно-патогенних штамів референтні значення перевищували кількості Сlostridium perfringens, Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli enterоpathogenic, Shigella, Proteus, Salmonella (табл. 2).

Обговорення

З МАЖХП пов’язують різноманітні порушення кількісного та якісного складу мікробіоти кишок, які, на нашу думку, починаються вже на стадії стеатозу печінки, оскільки пацієнти з МАСП відрізнялись більшою загальною бактеріальною масою порівняно з нормою та значенням групи інтактної печінки. Відсутність істотних відмінностей за кількістю окремих штамів бактерій між пацієнтами з МАСП та інтактною печінкою можна пояснити описаними труднощами, зумовленими різними фенотиповими та генотиповими особливостями пацієнтів та застосованими методами дослідження, оскільки метагеномний аналіз мікробіому кишечника почав вивчатись упродовж останнього десятиліття [8, 9].

Нами відзначено, що основну масу бактеріальних ДНК становили ДНК Bacteroidetes (50,66 %; порівняно з інтактною печінкою Δ = +8,29 %) та Firmicuts (31,97 ± 3,19 %; Δ = –10,87 %), тоді як 7,47 ± 2,69 % становили ДНК Actinobacteria (Δ = +40,41 %). За даними літератури, зростання ступеня стеатозу печінки супроводжувалось збільшенням кількості Firmicuts і відносним зменшенням Bacteroidetes, тоді як від стадії фіброзу печінки співвідношення бактерій не залежало [1].

Філ Bacteroidetes — грамнегативні облігатні анаероби, їхня мембрана містить сфінголіпіди, рідкісні для бактерій, вони можуть використовувати доступні цукри, але головним чином уживають глікани рослин, основним представником є Bacteroides fragilis group; запобігають колонізації патогенними бактеріями, резистентні до бета-лактамних антибіотиків. Філ Firmicutes (анаеробні Clostridia та аеробні Bacilli) містить головним чином грампозитивні бактерії з щільною стінкою, які можуть продукувати ендоспори для виживання у несприятливих умовах; має відношення до збереження енергії та патогенетично пов’язаний з розвитком ЦД та ожиріння: зокрема, Faecalibacterium prausnitzii відповідальні за мляве запалення при ожирінні, а Lactobacillus збільшені при ожирінні та зменшуються з втратою маси [10].

Наші результати загалом відповідають даним літератури, за якими у пацієнтів зі стеатогепатитом збільшується кількість Bacteroidetes та змінюється вміст Firmicutes, що призводить до зменшення відношення F/B [1, 6]. Хоча описана асоціація відношення F/B з масою тіла у здорових осіб [11], серед наших пацієнтів з МС та МАЖХП, ІМТ яких був вищим порівняно з особами з інтактною печінкою, ця особливість не спостерігалась, що збігається з думкою багатьох дослідників про контроверсійність значення його змін [9].

Незважаючи на невеликий відсоток, філ Actinobacteria належить до основних бактеріальних філів кишечника. Тут згадаємо статтю С. Binda та співавт. (2018), що носить промовисту назву «Актинобактерії: відносна меншість, що керує кишковим гомеостазом» (Actinobacteria: A relevant minority for the maintenance of gut homeostasis) [12]. Важливість філу Actinobacteria зумовлена також тим, що до них відносяться Bifidobacte–rium spp., які широко використовуються у ролі пробіотиків [12]. Незважаючи на виявлене загальне збільшення вмісту Actinobacteria порівняно з пацієнтами з інтактною печінкою на 40 %, за умов МАСП уміст Bifidobacterium spp. був у 10 разів менше за норму та у 20 разів менше, ніж серед осіб з інтактною печінкою.

Остаточно не вирішене питання щодо ролі дисбіозу кишок у розвитку ожиріння. За даними Е. Nistal та спів–авт. (2019), кількості штамів Blautia, Alkaliphilus, Flavobacterium та Akkermansia були зменшеними у пацієнтів з ожирінням незалежно від наявності МАЖХП [4]. Тому виявлене нами зменшення Akkemansia muciniphila можна пояснити не стільки МАСП, скільки наявністю ожиріння у цій групі (ІМТ = 32,48 ± 1,56 кг/м2). Однак з огляду на важливе значення філу Akkermansia, який збільшує товщину слизового шару та бар’єрну функцію кишок, поліпшує кишкову провідність, зменшує запальну відповідь при МАЖХП, поліпшуючи метаболізм та імунну відповідь [13], це має важливе клінічне значення. Також з надмірною масою тіла та ожирінням пов’язують уміст Firmicutes [1].

Висновки

Зміни мікробіому кишечника у пацієнтів з МАЖХП починаються вже на стадії стеатозу та проявляються збільшенням загальної бактеріальної маси на третину, нижчою кількістю облігатних штамів (Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacteroides thetaiotaomicron, Akkemansia muciniphila) та збільшенням вмісту умовно-патогенних штамів (Сlostridium perfringens, Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli enterоpathogenic, Shigella, Proteus, Salmonella) порівняно з пацієнтами з інтактною печінкою. Зміни метагеномного стану мікробіому кишечника пов’язані з масою тіла, системною гемоциркуляцією та ліпідним і вуглеводним метаболізмом.

Перспективи подальших досліджень. Проведення дослідження мікробіому кишок при різних фенотипах МАЖХП.

Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів та власної фінансової зацікавленості при підготовці даної статті.

Інформація про внесок кожного автора. Комариця О.Й. — концепція, написання тексту; Радченко О.М. — дизайн дослідження, редагування; Москва Х.А. — збирання первинного матеріалу; Боровець М.О. — набір матеріалу, статистична обробка.

Отримано/Received 03.07.2023

Рецензовано/Revised 31.08.2023

Прийнято до друку/Accepted 05.09.2023

Список литературы

Fadieienko H.D., Hridniev O.Ye., Kushnir I.E., Solomentseva T.A., Chernova V.M., Halchinska V. The role of intestinal microbiota, endotoxemia and systemic inflammation in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. Lvivskyi klinichnyi visnyk. 2022. 3–4(3940). 8-13. (In Ukrainian).
Safari Z., Gérard P. The links between the gut microbiome and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Cell Mol. Life Sci. 2019. 76(8). 1541-1558. DOI: 10.1007/s00018-019-03011-w.
Panasevich M.R., Peppler W.T., Oerther D.B., Wright D.C., Rector R.S. Microbiome and NAFLD: potential influence of aerobic fitness and lifestyle modification. Physiol. Genomics. 2017. 49(8). 385-399. DOI: 10.1152/ physiolgenomics.00012.2017.
Nistal E., Sáenz de Miera L.E., Ballesteros Pomar M., et al. An altered fecal microbiota profile in patients with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) associated with obesity. Rev. Esp. Enferm. Dig. 2019. 111(4). 275-282. DOI: 10.17235/reed.2019.6068/2018.
Plaza-Díaz J., Solís-Urra P., Rodríguez-Rodríguez F., et al. The Gut Barrier, Intestinal Microbiota, and Liver Disease: Molecular Mechanisms and Strategies to Manage. Int. J. Mol. Sci. 2020. 21(21). 8351. DOI: 10.3390/ijms21218351.
Vallianou N., Christodoulatos G.S., Karampela I., et al. Understanding the Role of the Gut Microbiome and Microbial Metabolites in Non-Alcoholic Fatty Liver Disease: Current Evidence and Perspectives. Biomolecules. 2021. 31. 12(1). 56. DOI: 10.3390/biom12010056.
Aragonès G., González-García S., Aguilar C., Richart C., Auguet T. Gut Microbiota-Derived Mediators as Potential Markers in Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Biomed Res. Int. 2019(2). 1-10. DOI: 10.1155/2019/8507583.
Cao Y., Yu M., Dong G., Chen B., Zhang B. Digital PCR as an Emerging Tool for Monitoring of Microbial Biodegradation. Molecules. 2020. 25(3). 706. DOI: 10.3390/molecules25030706.
Magne F., Gotteland M., Gauthier L., et al. The Firmicutes/Bacteroidetes Ratio: A Relevant Marker of Gut Dysbiosis in Obese Patients? Nutrients. 2020. 12(5). 1474. DOI: 10.3390/nu12051474.
Jandhyala S.M., Talukdar R., Subramanyam C., Vuyyuru H., Sasikala M., Reddy D.N. Role of the normal gut microbiota. World J. Gastroenterol. 2015. 21(29). 8787-8803. DOI: 10.3748/wjg.v21.i29.8787.
Koliada A., Syzenko G., Moseiko V., et al. Association bet–ween body mass index and Firmicutes/Bacteroidetes ratio in an adult Ukrainian population. BMC Microbiol. 2017. 17(1). 120. DOI: 10.1186/s12866-017-1027-1.
Binda C., Lopetuso L.R., Rizzatti G., Gibiino G., Cennamo V., Gasbarrini A. Actinobacteria: A relevant minority for the maintenance of gut homeostasis. Dig. Liver Dis. 2018. 50(5). 421-428. DOI: 10.1016/j.dld.2018.02.012.
Yu Y., Lu J., Sun L., Lyu X., Chang X.Y., Mi X., et al. Akkermansia muciniphila: A potential novel mechanism of nuciferine to improve hyperlipidemia. Biomed Pharmacother. 2021. 133. 111014. DOI: 10.1016/j.biopha.2020.111014.