Международный неврологический журнал 8 (30) 2009

Протягом тривалого часу судинні захворювання головного мозку залишаються однією з пріоритетних проблем у неврології (Е.И. Гусев, 2007). Експерти ВООЗ вважають, що і в найближчі десятиріччя відзначатиметься зростання поширеності даної патології, оскільки населення «старіє», а фактори ризику судинних епізодів усе збільшуються (Т.С. Міщенко, 2007).

Основним патологічним процесом, що уражає коронарні судини та артерії інших басейнів, вважають атеросклероз [1, 2]. Сучасні досягнення основної та експериментальної науки виявили фундаментальну роль запалення, що робить свій внесок на всіх стадіях атерогенезу: у процесі формування як самої атеросклеротичної бляшки, так і ушкодження стабільної атероми з тромботичною оклюзією у подальшому і розвитком серцево­судинних ускладнень [3].

На різноманітних моделях атеросклерозу поряд із накопиченням ліпідів у стінці артерій виникають ознаки запалення. Ідентифіковано кілька типів імунних клітин при атеросклеротичному лізисі у людей та тваринних моделей. Численні дослідження показали роль T­ і B­лімфоцитів і макрофагів (Мф) в атерогенезі [4–7]. Поряд із цим механізми імунообумовленої модуляції атеросклерозу залишаються нез’ясованими, але можуть включати продукцію проатеросклеротичних цитокінів, таких як інтерферон­g (IFN­g), інтерлейкін­1, фактор некрозу пухлини та секрецію атеропротективних автоантитіл.

У процесі розвитку атеросклеротичного лізису безпосередню участь беруть лейкоцити. Прозапальні цитокіни, що утворилися всередині атероми, забезпечують хемотаксичні стимули до адгезованих лейкоцитів, скеровуючи їх міграцію до інтими [8–9]. Слід зазначити, що в організмі людини існують функціонально полярні відповіді клітинних клонів CD4+ T­хелперів (Th1) і CD8+ T­супресорів (Th2), що залежать від продукованих ними цитокінів. Так, лімфокіни Th1­типу беруть участь в генезі орган­специфічних захворювань (наприклад, інсулінзалежний цукровий діабет), а лімфокіни Th2­типу домінують при алергічних захворюваннях, прогресуючому системному склерозі [24].

Під час розвитку лізису Т­лімфоцити приєднуються до макрофагів у інтимі. Скеровані кров’ю запальні клітини розташовуються в артеріальній стінці й обумовлюють місцеву запальну відповідь [3, 10–11]. З розвитком запального процесу активовані лейкоцити і власні клітини артерії можуть вивільняти фіброгенні медіатори [13]. Перехресна реакція між Т­лімфоцитами і макрофагами підвищує експресію потенційних прокоагулянтних тканинних факторів. Таким чином, коли розривається бляшка, індукований сигналами запалення тканинний фактор спричинює тромбоутворення, що призводить до найбільш гострих ускладнень атеросклерозу. Макрофаги також продукують тканинний фактор — головний прокоагулянт і тригер тромбозу в бляшках. Запальні медіатори регулюють експресію тканинного фактора макрофагами бляшок, чим демонструється есенціальний зв’язок між запаленням артерій та тромбозом [11].

Макрофаги є одними з перших клітин, що інфільтрують стінку артерії та регулюють ріст лізису від його початку до захоплення модифікованих ліпопротеїдів, продукції аполіпопротеїну (apo)­E та регуляції відкладення холестерину, секреції матриксу металопротеїназами при запаленні. За таких обставин редукція акумуляції макрофагів у артеріальній стінці призводить до вагомого захисту від атеросклерозу. Проте важливість інших клітин природженої імунної системи при атерогенезі ще не є цілком визначеною. Декілька досліджень атеросклерозу привертають увагу до нейтрофілів та NK­клітин (natural killer cells) [1].

Через полімодальну дію даних імунозапальних змін на сьогодні не існує універсальних медикаментозних препаратів для лікування хворих із церебральним атеросклерозом, які б на високому доказовому рівні служили захистом від церебрального інсульту. Саме тому церебральний атеросклероз (ЦАС) є провідним фактором ризику гострих порушень мозкового кровообігу поряд з артеріальною гіпертензією. Окрім цього, частими стали прояви раннього ЦАС на фоні «помолодшання» інсульту та «постаріння» населення в цілому [15, 16], що прямо вказує на актуальність запровадження новітніх методів антиатеросклеротичної терапії.

Єдиною групою препаратів, що зайняли важливу нішу в лікуванні хворих на атеросклероз, є статини, які мають плейотропну дію. Однак рекомендоване тривале їх застосування для досягнення позитивного ефекту супроводжується, на жаль, частими побічними ефектами (деменцією, рабдоміолізом, гепатобіліарними розладами та ін., згідно з доповідями FDA), що спонукає до пошуку новітніх церебропротекторів.

Припускають, що плейотропний ефект статинів відображає зміни мембрани холестерину і щільність ліпопротеїдів (ЛП), а також, імовірно, існують взаємозв’язки між мембраною холестерину, щільністю ЛП та клітинною функцією, які можуть бути причетними до патогенезу кардіоваскулярних та метаболічнх захворювань [17]. Для визначення плейотропного ефекту статинів використовують NK­клітинну цитотоксичність. NK­клітини відносяться до природженого імунітету та відзначаються властивостями розчинювати клітини пухлини in vivo [19]. На додаток, NK­клітини беруть участь у природженому імунітеті через продукцію цитокінів, таких як IFN­, у відповідь на продукцію інтерлейкінів (IL­12 і IL­18), що мають проатерогенні ефекти [20–22].

Дослідження відділу фармакології факультету наук здоров’я W. Li, C. Lidebjer et al. (Швеція, 2008) виявили, що у хворих з ІХС значно вищий рівень апоптозу NK­клітин. Також NK­клітини пацієнтів з ІХС були гіперчутливі до окислених ліпідів ex vivo, що служить індикатором механізму, який робить внесок у зниження рівня NK­клітин при ІХС [18]. Таким чином, NK­клітини ідентифікують з людськими судинними патологіями. Вони є ключовими елементами в ініціації та модуляції імунних відповідей.

NK­клітини активуються через взаємодію їх рецепторної активації (СD16) з їх лігандом на клітинах із нормальною антигенною презентацією або на самоушкоджених клітинах. Активація NK­клітин веде до швидкої продукції цитокінів, таких як IFN­g і TNF­a. Дані цитокіни впливають на клітинну активність Т­хелперів 1, макрофагів або ендотеліоцити судин. У свою чергу, активовані Мф здатні впливати на NK­клітини та ендотеліоцити. На додаток, NK­клітини мають цитолітичні властивості через продукцію перфорину й гранзимів. Цитокіни, обумовлені антигенною презентацією клітин чи NK­клітин (IFN­g, IL­12, IL­15 і IL­18), можуть порушувати активацію NK­клітин [14]. Взаємодія Ly49 рецептора на NK­клітинах із молекулою MHC класу I на всіх типах клітин може спричинювати інгібіцію цих функцій NK­клітин (рис. 1).

Проте дослідження N. Schiller et al. (Франція, 2002) вказує на те, що у мишей порушення цитолітичної активності NK вагомо не впливає на атеросклероз, а більш інтенсивний процес атеросклерозу також не пов’язаний ні з Т­, ні з В­лімфоцитами [23].

Щоб зрозуміти ефекти NK­клітино­обумовлених ефектів при атеросклерозі, можливо, необхідно більш уважно ставитися до відмінностей бляшок у навколишньому середовищі цитокінів. Виходячи з цього, можна вважати, що NKT­клітини регулюють атерогенний потенціал NK­клітин у Ly49A трансгенних реципієнтів. Проте дані Whitman вказують на те, що NKT­ і T­лімфоцити є вторинними щодо виражених дефектів NK­клітин, що спостерігаються в Ly49A мишей [20, 22]. Продовження досліджень у цьому напрямку є важливим для розуміння ролі природженого імунітету в атерогенезі, що, у свою чергу, дозволить запровадити новітні методи терапії судинних захворювань.

Виходячи з цього, нами було досліджено показники нейроімунологічного стану у хворих із церебральним атеросклерозом для з’ясування потенційних механізмів церебропротекції.

Матеріали і методи дослідження

Із популяції хворих на ЦАС (25 чоловіків та жінок віком 50–65 років) були сформовані дві групи дослідження: група А (15 хворих із діагнозом «атеросклеротична дисциркуляторна енцефалопатія ІІ стадії») та група В (10 здорових осіб для контролю). У свою чергу, група А була розділена на дві підгрупи за дуплексним критерієм GSM: група Аhy (6 пацієнтів із гіпоехогенними бляшками ЦАС) та група Аhe (9 пацієнтів із гетероехогенними атеросклеротичними бляшками).

Імунологічне обстеження включало кількісну оцінку різних субпопуляцій лімфоцитів непрямим імунофлюоресцентним методом за допомогою моноклональних антитіл виробництва ЗАТ «Сорбент­сервіс» (Москва) згідно з інструкцією фірми­виробника. Оцінку реакції проводили на проточному цитофлюориметрі Becton Dickinson, США [27].

За допомогою даного методу визначали такі субпопуляції лімфоцитів: CD3+­лімфоцити (Т­клітини); CD4+­лімфоцити (Т­хелпери); CD8+­лімфоцити (Т­цитотоксичні лімфоцити/супресори); CD16+­лімфоцити (NK­клітини), CD19+­лімфоцити (В­клітини). Рівень імунних комплексів у сироватці крові визначали за методикою В. Гашкова й ін. (1978) за допомогою 3,75% поліетиленгліколю з молекулярною масою 6000 [28]. Адгезивна активність нейтрофілів при дії нейробілків була вивчена спектрофотометричними методами [29]. Автоантитіла до нейроантигенів визначали за допомогою твердофазного ІФА за методикою Т.М. Черенько (1989) [30]. Дана методика визначає рівень антитіл до нейроспецифічних білків у сироватці крові. Принцип методу полягає в тому, що антитіла тестованого зразка взаємодіють з імобілізованим на твердій фазі антигеном, потім фіксують на собі антивидові антитіла (вторинні), кон’юговані з ферментом пероксидаза хріну. Кількість зв’язаного кон’югату визначається за допомогою хромогенного субстрату, причому інтенсивність забарвлення, що розвивається, пропорційна кількості антитіл у зразках. Нейробілки — основний білок мієліну (ОБМ) і нейроспецифічну єнолазу (NSЕ) — отримували за методом М.І. Лісяного і Л.Д. Любича (2001) [24]. Статистична обробка результатів проводилась за допомогою комп’ютерної програми Statistica’6^® (1998).

Результати і їх обговорення

Результати імунологічного дослідження показали, що рівні лейкоцитів та лімфоцитів у хворих на ЦАС (групи А) суттєво не відрізнялися від таких у здорових осіб (конт­рольної групи В). Проте рівні субпопуляцій лімфоцитів у хворих на ЦАС були порушені. Так, у групі А вірогідно констатувалися лімфоцитоз у субпопуляції CD8 і лімфоцитопенія у субпопуляції CD16, що обумовило зниження імунорегуляторного індексу (CD4/CD8) у хворих на ЦАС (табл. 1).

Лімфоцитоз у субпопуляції Т­лімфоцитів­супресорів (CD8) і лімфоцитопенія у субпопуляції NK­клітин (CD16) свідчать про дисбаланс імунної відповіді у хворих групи А. При цьому у хворих з гетероехогенними бляшками ЦАС (підгрупа Аhe) мав місце більш виражений розлад імунного балансу.

У хворих на ЦАС відзначено високий рівень імунних комплексів, що перевищував значення контрольної групи в 1,6 раза, а також високий рівень нейросенсибілізації (табл. 2). Слід відзначити, що високий рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) відрізнявся у підгрупах хворих на ЦАС. Так, рівень ЦІК був вищим в 1,4 раза у групі Ahe порівняно з групою Ahy (рис. 3).

Аналіз нейросенсибілізації показав, що у хворих на ЦАС має місце вірогідно підвищена чутливість нейтрофілів до альбуміну, основного білка мієліну (Sобм) та нейроспецифічної єнолази. При цьому сенсибілізація до NSE у групі Ahy вірогідно перевищувала — в 1,5 раза — сенсибілізацію нейтрофілів до NSE у групі Ahe та в 3,6 раза — у групі В (рис. 4).

Високий рівень сенсибілізації нейтрофілів до NSE у групі Ahy може вказувати на максимальний рівень нейроантигену в сироватці крові порівняно з групою Ahe. На користь цього свідчить і відносно менша концентрація ЦІК у групі Ahy — ймовірна ознака лише часткового зв’язування автоантитіл із нейроантигенами [24].

Середньогруповий показник рівня автоантитіл до основного білка мієліну у групі А не відрізнявся суттєво від такого в групі В. Однак у підгрупі Ahy він був вірогідно високого рівня (табл. 2, рис. 5).

Наявність у сироватці крові хворих групи А високих рівнів ЦІК і автоантитіл до ОБМ свідчить про порушення проникності ГЕБ. Оскільки загальний рівень лімфоцитів у хворих групи А не порушувався, в той час як мав місце дисбаланс імунного профілю та зниження CD16­клітин поряд із збільшенням циркулюючих імунних комплексів та гіперсенсибілізацією нейтрофілів до нейроспецифічних білків, можна вважати, що у розвитку ЦАС хворих групи А домінують саме автоімунні ланки імунопатогенезу.

При виборі шляхів корегування даного розладу імунної системи при ЦАС слід виходити з профілю імунної відповіді у хворих — тип Th2, що відповідає за гуморальну імунну відповідь. За таких обставин доречним є посилання на дослідження відділу фармакології факультету наук здоров’я W. Li, C. Lidebjer et al. (Швеція, 2008), у якому було виявлено, що у хворих на ІХС значно вищий рівень апоптозу NK­клітин. Також NK­клітини в пацієнтів з ІХС були гіперчутливі до окислених ліпідів ex vivo, що служить індикатором механізму, який робить внесок у зниження рівня NK­клітин при ІХС [18]. Отже, відновлення рівня NK­клітин, імовірно, і буде ключовим елементом в ініціації та модуляції імунних відповідей при ЦАС.

При виборі препаратів для церебропротекції ми керувалися трьома положеннями:

1. Відновити проникність ГЕБ, яка регулюється астроцитами через рівень цАМФ в клітинах ендотелію [24].

2. Справляти антиоксидантний вплив, що, ймовірно, дозволить захистити NK­клітини (зважаючи на дані W. Li, C. Lidebjer et al., 2008).

3. Ініціювати реакцію імунної системи по Th1­шляху та стимулювати CD16­клітини, які мають важливе значення у розвитку атеросклеротичної бляшки [25]).

Виходячи з цього, для нашого дослідження було обрано депротеїнізований гемодіалізат, що містить широкий спектр низькомолекулярних компонентів клітинної маси і сироватки крові молочних телят, — солкосерил (препарат компанії Solco, Швейцарія). Сукупність кількох фізіологічно активних інгредієнтів, ферментних комплексів та мікроелементів у солкосерилі надає йому багатофункціональних нейропротективних властивостей, що дозволяє покладати надії на дотримання трьох необхідних положень нашого дослідження.

Таким чином, усі хворі групи А нашого дослідження пройшли 10­денний курс терапії солкосерилом — по 10 мл внутрішньовенних крапельних ін’єкцій на фізіологічному розчині. Дані обстеження проводилися як напередодні дослідження у групах А і В, так і на другий день після завершення курсу терапії солкосерилом у групі А.

Застосування курсового лікування солкосерилом вірогідно нормалізувало ряд нейроімунологічних показників хворих на ЦАС (табл. 3).

Зокрема, у крові хворих групи Аhе на 13 % знижувався відносний рівень Т(CD8)­супресорів на фоні зростання (на 20 %) відносної кількості NK(CD16)­клітин, що є ознакою відновлення імунного балансу (рис. 6).

Також у сироватці крові хворих групи Аhy зменшувався на 20 % рівень циркулюючих імунних комплексів на фоні зниження (в 1,5 раза) сенсибілізацї нейтрофілів до основного білка мієліну (рис. 7).

У хворих із групи Ahy після завершення курсу солкосерилу вірогідно відновлювалася лише сенсибілізація нейтрофілів до нейроспецифічної єнолази (17 %), у той час як імунний дисбаланс став на 15 % ще більш вираженим (табл. 3, рис. 6, 8).

Під впливом солкосерилу кардинально змінився середньогруповий показник рівня автоантитіл до основного білка мієліну, рівень якого до лікування був високим в обох групах Аhу та Аhе: у групі Аhу набув низького значення (становив 19,70 ± 7,61 ум.од. при нормі 25–28 ум.од.), а у групі Аhе, навпаки, відзначалася тенденція до його зростання (табл. 3, рис. 9).

Дискусія

Отримані результати даного дослідження вказують на порушення клітинних, гуморальних та автоімунних реакцій імунної системи у хворих на ЦАС. При цьому характер атеросклеротичних бляшок обумовлює специфічність імунного профілю хворих. Так, у хворих з гіпоехогенними атеросклеротичними бляшками більшою мірою виражені автоімунні реакції, що проявляється вірогідно високими рівнями в сироватці крові автоантитіл до основного білка мієліну та гіперсенсибілізацією нейтрофілів до нейроспецифічної єнолази. У хворих із гетероехогенними атеросклеротичними бляшками домінують порушення клітинного імунітету у вигляді зниження рівня NK­клітин (CD16) на фоні вірогідного імунного дисбалансу.

Застосування курсового лікування солкосерилом вірогідно нормалізує ряд нейроімунологічних показників у хворих із гетероехогенними бляшками ЦАС, а саме: у сироватці крові зменшується рівень циркулюючих імунних комплексів (на 20 %), сенсибілізацї нейтрофілів до основного білка мієліну (в 1,5 раза), а також відносний рівень Т(CD8)­супресорів (на 13 %) на фоні зростання відносної кількості NK(CD16)­клітин (на 20 %), що є ознакою відновлення імунної системи. Однак у хворих із гіпоехогенними атеросклеротичними бляшками після завершення курсу солкосерилу вірогідно зменшувалася лише сенсибілізація нейтрофілів до нейроспецифічної єнолази (17 %), в той час як імунний дисбаланс CD8­ і CD16­лімфоцитів став ще більш вираженим (на 15 %).

Висновки

1. У хворих на ЦАС виявляється дисбаланс у складі основних субпопуляцій лімфоцитів, особливо цитотоксичних клітин CD8+ і CD16+, відмічаються високий рівень імунних комплексів і висока активність клітинних та гуморальних автоімунних реакцій до нейроантигенів.

Залежно від характеру атеросклеротичних бляшок найбільша різниця була в рівні ЦІК: при гетерогенних бляшках (група Ahе) рівень ЦІК був в 1,4 раза більший, ніж при гіпогенних бляшках (група Ahy), та в 2–2,5 раза більший за рівень ЦІК у контрольній групі (групі В).

2. Виявлено, що особливості змін імунного статусу та рівня автоімунних реакцій певним чином пов’язані з характером атеросклеротичних змін на УЗДГ, а саме з гіпо­ та гетероехогенністю бляшок у судинах головного мозку.

3. Отримані дані доводять сприятливий нейроімуномодулюючий вплив застосування препарату солкосерил на різні ланки імунної системи при церебральному атеросклерозі.

Виявлено, що застосування солкосерилу призводить до зменшення рівня ЦІК та нормалізації деяких показників імунної системи, що дозволяє стверджувати його позитивний вплив на імунну систему та запально­деструктивні процеси в ЦНС.

4. Зниження активності клітинних нейроімунних реакцій при введені солкосерилу, а саме зменшення рівня нейросенсибілізації нейтрофілів (визначені в реакції адгезії нейтрофілів у присутності нейробілків — основного білка мієліну та альбуміну), свідчить про позитивний вплив цього препарату на патологічні автоімунні реакції у мозку при ЦАС.

5. Результати дослідження дають підстави рекомендувати диференційоване застосування солкосерилу залежно від характеру атеросклеротичної бляшки на УЗДГ, що супроводжується особливими автоімунними порушеннями.