Международный неврологический журнал 5(9) 2006

В настоящее время зарегистрировано большое количество генетических заболеваний. По базе данных целого ряда генетических заболеваний, публикуемой и постоянно обновляемой в Университете Джона Хопкинса, Балтимор, штат Мериленд, США, на 31 октября 2004 г. этот список включает 15 690 генетических заболеваний.

Многие заболевания из предыдущего списка характеризовались наличием известных метаболических маркеров и/или установленных генов. Как детский невролог, я хотел бы отметить, что при осмотре больных с неврологическими заболеваниями без очевидной этиологии или патогенеза мы всегда должны думать о возможности нейрогенных заболеваний.

Из неврологических заболеваний, которые я только что упомянул, мне пришлось работать с группой метаболических нарушений, известных как болезни лизосомного накопления. Они вызываются дефицитом одного фермента, действующего в маленькой вакуоли, которая называется мизосола, своего рода пищеварительная органелла клетки. Каждое заболевание характеризуется потерей активности одного фермента и накоплением такого специфического соединения, как липид, углевод, белок и другие биологически активные метаболические соединения.

Лизосома является маленькой вакуолью с более чем 50 различными ферментами, работающими на гидролиз разных соединений в кислых условиях. Когда появляется недостаток активности одного фермента, субстрат для него больше не будет расщепляться и станет накапливаться в этой вакуоли, что приводит к нарушению функции данной клетки. С клетками разных органов и тканей приходят симптомы — поражение мозга (нейронов), болезни печени (поражение клеток печени), болезни сердца (поражение клеток миокарда) и болезни мышечных волокон.

Целью моего фундаментального исследования стало соединение, называемое ганглиозидом GM1 со сложной химической структурой. Боковая цепочка сахара расщепляется последовательно, начиная с галактозы (Гал), потом N-ацетилгалактозамина (ГалNАк), галактозы (Гал) и глюкозы (Глк). Если отсутствует фермент, расщепляющий молекулу галактозы, т.е. β-галактозидаза, она сохраняет свое состояние и накапливается в лизосоме.

При ганглиозидозе электронная микроскопия выявляет уникальные луковицеобразные включения в цитоплазму. Они называются мембранозным цитоплазменным телом. Было определено, что это включение специфично для ганглиозидозы, GM1 и GM2.

Много лет назад я очистил эти включения, мягко гомогенизируя ткань мозга с сохранением их структуры. Это продукт, полученный мною 35 лет назад.

Картины двух заболеваний, GM1-ганглиозидоза и GM2-ганглиозидоза, представляют накопление разных соединений, соответственно GM1 и GM2.

Мы можем диагностировать эти заболевания по анализу фермента β-галактозидазы в лейкоцитах периферической крови.

У здоровых людей определяется широкая вариабельность активности фермента. У больных этими болезнями активность фермента почти полностью утрачивается. Активность фермента у родителей облигатных гетерозиготных носителей находится на промежуточном уровне.

Существует несколько клинически четких фенотипов в заболеваниях генетического дефицита β-галактозидазы.

Все больные имеют разные мутации одного и того же гена на хромосоме 3 и экспрессируют различные ферментные особенности, приводя к заболеваниям мозга или костей с разными клиническими проявлениями.

В разных местах гена мы обнаружили большое количество мутаций.

Большинство мутаций были определены в моей лаборатории и коллегами в Японии. Однако мы не смогли соотнести генотип и фенотип больных в этой схеме.

Хотя нельзя было предсказать клиническое течение или степень заболевания по анализу гена, мы смогли разработать простой метод генного диагноза при помощи экстракции, ПЦР-амплификации и электрофореза гена больного. Это случай взрослого GM1-ганглиозидоза с общей мутацией среди больных. Почти у всех больных после ферментации наблюдаются две полосы, обозначающие появление нового ограничения действия фермента в результате замещения в одном основании при этой мутации. У здоровых людей ген нечувствителен к ингибирующему ферменту, и первоначальный одиночный ген остается без изменений.

Далее этот простой метод сделал возможным четко и надежно диагностировать гетерозиготных носителей. Электрофорез вызвал появление двух полос у всех больных, а у здоровых людей в другом месте была только одна полоса. Наблюдалось сочетание этих двух моделей, подтверждающее гетерозиготность у этих людей.

Проведя большую работу по генетическому анализу заболеваний, связанных с дефицитом β-галактозидазы, я занялся терапевтическим аспектом. Сейчас мы не можем лечить или предупредить болезни мозга при первичных генетических метаболических заболеваниях, хотя при некоторых заболеваниях вследствие вторичного метаболического эффекта (фенилкетонурия (заболевание печени) или кретинизм (врожденный гипотиреоз — заболевание щитовидной железы)) профилактика нарушения функций мозга возможна. Сейчас уже предложено провести несколько исследований различных заболеваний на разных патологических уровнях. Но в лечении поражений мозга клинического успеха пока нет.

Мы предлагаем новый метод лечения, который мы называем химической сопутствующей терапией.

В результате экстенсивного анализа мутантных генов, экспрессирующих мутантные белки, мы обнаружили 3 типа протеиновых аномалий: 1) белок синтезируется; 2) белок синтезируется, но немедленно расщепляется, так как молекула в клетке нестабильная; 3) белок в клетке не обладает ферментной активностью, хотя стабильно существует в ней. Мы решили направить наши действия на фермент 2-го типа.

Для стабилизации белка с несовершенной структурой при нейтральном рН, где синтезируется молекула, мы ввели в клетку особое соединение с низкой молекулярной массой, по структуре аналогичное субстрату. Это особое соединение связывается с мутантным энзимом и транспортируется в лизосому, где, как ожидается, энзим и будет работать. В этой вакуоли в кислых условиях комплекс автоматически растворяется, мутантный ген становится стабильным и начинает работать как активный белок. Короче говоря, это соединение своеобразно, ибо в физиологическом состоянии оно не существует.

В 1995 г. мы впервые сделали сообщение об этом явлении с галактозой для α-галактозидазы, фермента болезни Фабри. В 1999 г. в продаже появилось соединение 1-деоксигалактонойримицин, применяемое при болезни Фабри, затем соединение NOEV для лечения заболевания мозга GV1-ганглиозидоза.

Существует два требования к воздействию на мутантные клетки и ткани. Первое: мутантный белок должен обладать ферментативной активностью, но не ускорять активность, так как он нестабилен в месте биосинтеза. Второе: соединение должно быть с низкой молекулярной массой, чтобы оно могло связаться с мутантным белком. Я не буду больше говорить о деталях теории этой новой концепции.

Вначале мы начали проводить скрининг культур фибробластов больных, которые мы получили от многих ученых и медицинских исследователей всего мира. При определенной концентрации в питательной среде явно утраченная ферментная активность чрезвычайно возрастает в некоторых клеточных штаммах после нескольких дней инкубации. Как уже говорилось, мы не можем воздействовать на клетки без ферментного белка. Поэтому анализ клетки следует проводить заранее. В общем, младенцы и подростки, больные GM1-ганглиозидозом, реагировали лучше, чем взрослые с GM1-ганглиозидозом или болезнью Моркита Б. В целом около 30% больных имели положительную реакцию.

Мы ввели ганглиозиды в культуры фибробластов. Уровень GM1 в клетках больного чрезвычайно увеличился (R201C), чего не отмечалось в здоровых клетках. Однако в клетках больных, инкубированных NOEV, отмечалось увеличение ферментной активности и не накапливали GM1. Это является прямым свидетельством того, что соединение проникло в клетки и восстановило ферментную активность для гидролиза субстрата.

Затем мы приступили к экспериментам на животных. Первым шагом было получить нокаутированную мышь. Нокаутировать означало разрушить ген-мишень в геноме экспериментального животного, обычно мыши, в нашем случае — ген β-галактозидаза. Почти 10 лет назад нам удалось генерировать нокаутированную мышь. У животных развиваются прогрессирующие двигательные нарушения через 3-4 месяца после рождения, такие как спастический паралич, тремор, возможно, мозжечкового происхождения, и другие неврологические аномалии.

Они умирали через 7-10 месяцев после рождения из-за затруднений в питании и недоедания, включая парашютный рефлекс у нокаутированной мыши.

Потом мы ввели как трансген мутантные гены человека, специфические к некоторым клиническим формам β-галактозидазной недостаточности. Такие мыши с моделью болезни, которых мы называем трансгенными мышами, выделяли фенотип-специфические мутантные энзимы, клиническое течение заболевания у них было разным и зависело от введенного гена. Когда вводился нормальный ген человека, мышь становилась неврологически абсолютно здоровой. Это пример успешной генной ферментной терапии этим энзимом. Из этих полученных мышей мы выбирали животных, экспрессирующих мутацию R201C, представляющую юношеский GM1-ганглиозидоз, так как эта мутация лучше всего отвечала на NOEV в экспериментах на клетке.

После перорального введения водного раствора NOEV все ткани, включая мозг, продемонстрировали заметное повышение активности энзима.

Окрашивание ткани мозга показало повышение активности энзима и понижение накопления субстрата GM1 и его аналога — соединения GA1.

Это прямое свидетельство того, что после перорального введения NOEV попадает в кровоток через кишечник, а затем проходит через барьер кровь — мозг и усиливает активность энзима в клетках нейрона.

Мы еще не подтвердили профилактические эффекты на модели мыши, но предварительный эксперимент предполагает некоторое улучшение неврологического статуса у симптоматичных мышей через 6 мес. после начала заболевания. Сейчас мы проверяем клинический эффект на долгосрочной базе, на предклинической стадии заболевания.

Нас не удивило, что это же соединение эффективно как ингибитор при другой β-галактозидазе, галактосилцерамидазе. Это энзим, ответственный за болезнь Краббе, или глобоидно-клеточную лейкодистрофию. Мы надеемся, что эту молекулярную терапию можно проводить соединением NOEV и при болезни Краббе.

Фактически в эксперименте NOEV более эффективен как ингибитор галактозилцерамидазы, чем GM1 β-галактозидазы. Сейчас мы проверяем восстанавливающий эффект фермента на клетках Краббе.

Кроме того, мы пытаемся охарактеризовать многие другие подобные соединения, чтобы обнаружить другие лекарства, специфические к мутациям.

Сейчас мы расширяем цель наших исследований до исследования других лизосомных заболеваний. В настоящее время мы сосредоточились на галактозе или глюкозе, распознающих энзимы с α- или β-стерической структурой, а именно β-галактозидазе, β-глюкозидазе, α-галактозидазе и α-глюкозидазе. Кроме того, мы не забываем и о других подобных соединениях и энзимах. В частности, метахроматическая лейкодистрофия является относительно частым заболеванием среди болезней лизосомного накопления. Сульфатид является производным галактозилцерамида, и его органический синтез не очень сложен.