Международный неврологический журнал 5(9) 2006

Вступ

Важливою причиною розвитку нейродеструктивних процесів при РС є автоімунна реакція, що виникає внаслідок вірусної інфекції [3]. У відповідь на вірусне інфікування в ураженому організмі проявляється цитотоксична дія імунокомпетентних клітин, а також дія специфічних імуноглобулінів на клітини власних тканин. При РС у першу чергу зазнають пошкодження мієлінові оболонки олігодендроцитів. У місці такого пошкодження скупчуються макрофаги та астроцити, що синтезують фактор некрозу пухлини α(ФНП-α), який стимулює Т-лімфоцити до продукції інтерферону-γ. Останній підсилює утворення молекул адгезії, що забезпечують проникнення активованих клітин через гематоенцефалічний бар'єр у тканини мозку, і, крім того, сприяє процесам руйнування мієліну. Показано, що таку дію інтерферону-γ здатний пригнічувати інтерферон-β [9], який є глікопротеїном із молекулярною масою 20 кDa, що продукується фібробластами й клітинами ендотелію. Специфічні рецептори інтерферону-β виявлено на поверхні більшості досліджених імунокомпетентних клітин, зокрема на малих Т-лімфоцитах, NK-клітинах, еозинофілах та клітинах-попередниках із кісткового мозку [6].

Інтерферон-β характеризується плейотропною дією на клітини-мішені, що реалізується через цитотоксичний і цитостатичний ефекти цього цитокіну та впливає на гуморальний і клітинний імунітет. Встановлено також, що інтерферон-β регулює продукцію клітинами різних цитокінів і здатний гальмувати ріст пухлинних та інфікованих вірусом клітин [1]. Крім того, він опосередковано підвищує імунний захист шляхом активації імунокомпетентних клітин (моноцитів) та підвищення рівня експресії білків головного комплексу гістосумісності (ГКГ) типу І та експресії пухлиноасоційованих антигенів [2].

Наведені дані свідчать про обгрунтованість використання препаратів інтерферону-β у лікуванні хворих на РС. Метою досліджень, результати яких наведені в цьому розділі, було вивчення впливу лікування Бетафероном (інтерферон-β, SCHERING, Німеччина) на цитотоксичну дію Ig, отриманих із плазми крові хворих на РС, яким вводили Бетаферон упродовж 6 місяців. Для оцінки цитотоксичної дії Ig визначали: 1) кількість живих і мертвих людських лейкемічних Т-лімфоцитів лінії Jurkat за тестом із використанням барвника трипанового синього; 2) апоптичну фрагментацію ДНК цих клітин за умов дії на них препаратів Ig, виділених нами із плазми крові хворих на РС.

У доступній нам науковій літературі ми не виявили даних щодо біологічної, зокрема цитотоксичної, дії препаратів Ig, одержаних із плазми крові хворих на РС, залежно від ефективності лікування цих хворих.

Матеріали та методи дослідження

У дослідженні використано 20 зразків плазми крові: 10 — від клінічно здорових донорів і 10 — від хворих на РС. Забір крові здійснювали на початку дослідження та через різний час після лікування хворих Бетафероном (SCHERING, Німеччина).

Для отримання плазми гепаринізовану венозну кров (кінцеве розведення 1 : 100) центрифугували упродовж 30 хв. Виділення препаратів Ig здійснювали за описаною методикою [4]. Концентрацію білка в препаратах визначали за методом Лоурі [10]. Білковий склад отриманих Ig аналізували електрофорезом у градієнті концентрації ПААГ (6–17,5 %) у присутності 0,1% додецилсульфату натрію [12]. Препарати Ig зберігали при –20 °С у присутності гліцерину (Sigma, США).

Як об'єкт для дослідження цитотоксичної та проапоптичної дії Ig використовували людські лейкемічні Т-лімфоцити ліній Jurkat і MT-4, а також лейкемічні В-клітини лінії Namalwa. Клітини культивували у флаконах Карреля в поживному середовищі RPMI-1640 (Sigma, США) із додаванням 10% сироватки крові ембріонів ВРХ (Sigma, США), 50 мкг/мл гентаміцину (Sigma, СШA) до досягнення клітинами субконфлюентного стану. У досліди брали клітини в концентрації 1,5 х 10 6  клітин/мл, які висівали у 24-лункові культуральні пластикові планшети. Після двогодинної інкубації в лунки із суспензією клітин додавали досліджувані препарати Ig (кінцева концентрація 0,7 мг білка/мл) та залишали на 24 години.

Визначення життєздатності Т-клітин лінії Jurkat за умов дії препаратів Ig здійснювали, використовуючи 0,1% водний розчин барвника трипанового синього, підраховуючи кількість незафарбованих (живих) і зафарбованих (мертвих) клітин у гемоцитометричній камері під світловим мікроскопом.

Ознаки апоптозу в Т-клітинах лінії Jurkat під впливом досліджуваних препаратів Ig виявляли за проявом фрагментації ДНК цих клітин під час електрофорезу в гелі агарози, як описано [9]. Розподіл фракцій деградованої ДНК визначали, використовуючи програму GelPro 3.1.

Статистичне опрацювання результатів визначення цитотоксичної дії препаратів Ig здійснювали за допомогою програми OriginPro 7.0, вираховуючи за t-критерієм Стьюдента. Достовірними вважали зміни показників за умови Р < 0,05.

Результати та їх обговорення

У переважної більшості (9 із 10) пацієнтів була цереброспінальна форма захворювання. Однакова їх кількість (5 і 5) була з легким і середнім ступенем тяжкості патологічного процесу. У цій групі було значно більше жінок, ніж чоловіків (відповідно 2,3 : 1). В усіх хворих був ремітуючо-рецидивуючий тип перебігу захворювання з різною його тривалістю.

Забір крові хворих здійснювали на початку дослідження та через 3 і 6 місяців після початку їх лікування Бетафероном. Пацієнти отримували Бетаферон шляхом підшкірних ін'єкцій у дозі 250 мкг через день.

На рис. 1 наведено результати дослідження життєздатності Т- і В-клітинних ліній під впливом препаратів Ig із плазми крові хворих на РС. Цитотоксичну активність цих препаратів визначали на підставі даних, отриманих після фарбування мертвих клітин барвником трипановим синім.

Встановлено, що Ig, ізольовані з плазми крові хворих на РС, характеризуються нижчою цитотоксичною активністю щодо Т-клітин (лінія МТ-4) порівняно з Ig плазми крові клінічно здорових донорів. У випадку біотестування Ig плазми крові хворих на тяжку форму РС ця відмінність у цитотоксичній активності препаратів Ig була статистично достовірною (Р < 0,05).

Для того щоб з'ясувати тип загибелі Т-клітин під впливом досліджуваних препаратів Ig, було проаналізовано стан ДНК цих клітин на підставі результатів її електрофоретичного дослідження в гелі агарози. Відомо, що на електрофореграмі ДНК імунокомпетентних клітин, які гинуть шляхом апоптозу, має вигляд так званої «драбини», тоді як на електрофореграмі ДНК клітин, що гинуть шляхом некрозу, виявляється суцільна пляма ДНК із розмитими краями [7]. Із даних, наведених на рис. 2, видно, що препарати Ig, виділені з плазми крові клінічно здорових донорів, здійснюють свою цитотоксичну дію щодо Т-клітин лінії Jurkat головним чином шляхом апоптозу, оскільки ДНК цих клітин чітко фрагментована на моно- та олігонуклеосомні частини.

На гістограмах наведено результати денситометричної обробки цих електрофореграм із використанням комп'ютерної програми (OriginPro 7.0) та графіки Excel.

На електрофоретичних доріжках із позначкою «K» у лівій і правій частинах (рис. 2) видно, що в Т-клітин лінії Jurkat має місце деяка фрагментація клітинної ДНК внаслідок спонтанного апоптозу, який відбувається в цих клітинах навіть за відсутності зовнішнього впливу на них. За умов дії на вищезгадані клітини препаратів Ig із плазми крові контрольних клінічно здорових донорів у більшості випадків помірно зростає вираженість проапоптичної фрагментації ДНК цих клітин. Зокрема, цей вплив Ig добре виражений у випадку дії препаратів Ig, отриманих від донорів № 18–20, 22–27. Що стосується тестування препаратів Ig, отриманих із плазми крові донорів № 17 і 21, то в цих випадках нами не виявлено чіткої проапоптичної дії Ig від донора № 17, а така дія Ig від донора № 21 була слабко вираженою. Причинами такої дещо відмінної дії Ig цих 2 донорів (№17 і 21) порівняно з добре вираженою проапоптичною дією Ig переважної більшості використаних донорів (9 і 11 донорів) можуть бути їх індивідуальні особливості або функціональний стан донорів на момент забору крові.

Аналіз фрагментації ДНК Т-клітин лінії Jurkat за умов дії на ці клітини препаратів Ig із плазми крові хворих на РС засвідчив певну неоднозначність біологічної активності даних препаратів (рис. 3–4). На цих рисунках наведено результати впливу на фрагментацію ДНК Т-клітин лінії Jurkat препаратів Ig, ізольованих із плазми крові 10 хворих на РС, позначених номерами 3, 6, 7, 9, 13, 41–45. Згадані пацієнти перебували на різних стадіях їх лікування Бетафероном: а — через 3 місяці лікування, b — через 6 місяців, с — через 9 місяців після початку лікування.

Як видно з даних, наведених на рис. 3, препарат Ig із плазми крові пацієнта № 3 до лікування Бетафероном і через 3 місяці після початку такого лікування не володів здатністю індукувати апоптоз Т-клітин. У той же час Ig цього ж пацієнта, отриманий із його плазми крові через 9 місяців, набував вираженої здатності індукувати апоптоз Т-клітин, про що свідчить чітка проапоптична фрагментація ДНК цих клітин.

Аналогічна часова динаміка зміни проапоптичної активності Ig була характерною й для пацієнтки № 6: тут препарат Ig із плазми крові хворої через 3 місяці після початку лікування суттєво не впливав на фрагментацію ДНК Т-клітин, тоді як препарат Ig цієї ж пацієнтки через 6 місяців після початку лікування Бетафероном набував такої властивості. Така ж закономірність виявилася й у хворої № 42: здатність Ig із її плазми крові руйнувати ДНК Т-клітин через 6 місяців після початку лікування Бетафероном (доріжка 42b) була значно краще вираженою, ніж до такого лікування (доріжка 42).

Отже, у 3 хворих на РС (пацієнти № 3, 6 і 42), яких лікували Бетафероном, мало місце виразне зростання проапоптичної активності Ig плазми крові, що відбувалося в процесі такого лікування. Необхідно зазначити, що в названих пацієнтів до лікування Ig плазми крові не мали вираженої здатності індукувати апоптоз Т-клітин. Водночас характер цих змін чітко корелював із клінічними особливостями перебігу РС: у даних пацієнтів під впливом лікування Бетафероном чітко зменшилася кількість загострень і вираженість рухових розладів за шкалою EDSS.

Іншу групу склали пацієнти із слабковираженою реакцією їх системи Ig на лікування Бетафероном. Сюди можна віднести хворих на РС за номерами 7, 9, 13, 41, 43–45. У них лікування Бетафероном не супроводжувалося помітним зростанням проапоптичної активності Ig плазми крові, яку оцінювали за здатністю Ig індукувати проапоптичну фрагментацію ДНК. Необхідно зазначити, що, за винятком пацієнта № 7, Ig решти хворих на РС ще до початку лікування Бетафероном мали виразну проапоптичну активність (наприклад, пацієнт № 41). Отже, у цих пацієнтів проапоптична активність Ig більше не зростала.

У пацієнта № 7 проапоптична активність Ig плазми крові до лікування була практично відсутньою й через 3 місяці лікування Бетафероном не змінювалася. Очевидно, час спостереження був тут занадто коротким (3 місяці), щоб виявити виразні зміни цієї активності Ig плазми крові.

Зворотню динаміку зміни проапоптичної активності Ig плазми крові хворих на РС у процесі їх лікування Бетафероном виявлено в пацієнтів № 43 і 44. У них лікування Бетафероном супроводжувалося деяким зниженням проапоптичної активності Ig плазми їх крові. Ці дані, як і у вищеописаних випадках, корелюють із клінікою РС. Певне зниження проапоптичної активності Ig плазми крові в деяких хворих на РС відповідає відсутності позитивної динаміки у клінічному перебігу цього захворювання.

Висновки

Отже, аналіз усереднених даних щодо залежності цитотоксичної проапоптичної активності препаратів Ig із плазми крові хворих на РС від тяжкості цієї патології засвідчив зниження такої активності зі зростанням тяжкості захворювання у 3 із 10 обстежених хворих. Разом з тим результати дослідження динаміки проапоптичної дії препаратів Ig упродовж 3- і 6-місячних курсів лікування хворих свідчать про неоднозначний характер змін проапоптичної активності препаратів Ig плазми крові окремих хворих на РС із різним ступенем прояву захворювання, а також до і після лікування цих хворих Бетафероном.

Хворі на РС із відносно високою цитотоксичною активністю Ig плазми крові не реагують подальшим зростанням такої активності у відповідь на лікування Бетафероном. Результати такого спостереження корелюють із клінічними показниками стану цих хворих під час їх лікування Бетафероном.

Лікування Бетафероном сприяє посиленню апоптозу активованих автореактивних Т-клітин. Ця дія є найбільш вираженою при ремітуючо-рецидивуючому перебігу РС у хворих із повними ремісіями, незважаючи на тяжкість загострень у цих хворих. Клінічні загострення РС корелюють із процесами апоптозу ДНК автореактивних Т-клітин, що ми опосередковано спостерігали, вивчаючи цитотоксичну активність Ig, плазми крові щодо різних Т- і В-клітинних ліній. Тому визначення цитотоксичної активності Ig, виділених із плазми крові хворих на РС, можна використовувати як важливий діагностичний критерій тяжкості та перебігу РС, а також з метою прогностичної оцінки ефективності його лікування.

Узагальнюючи, слід зазначити, що, за даними проведених нами досліджень, Бетаферон може сприяти ініціації апоптичних процесів у ДНК автореактивних Т-лімфоцитів, що є прогностично сприятливою ознакою при РС. Ці висновки було зроблено на підставі вивчення цитотоксичної активності Ig, виділених із плазми крові хворих різних клінічних груп. Виявили зростання цитотоксичної активності Ig залежно від тривалості лікування хворих. Водночас нами виявлено прямопропорційну залежність між цими змінами на молекулярному рівні та клінічними особливостями захворювання на РС. Зокрема, показано, що зменшення кількості загострень у хворих, повний вихід з них, незважаючи на їх сильну вираженість, а також зменшення ступеня тяжкості РС за шкалою рухових розладів EDSS, відповідають зростанню цитотоксичної активності Ig плазми крові хворих, їх здатності індукувати апоптоз автореактивних Т-клітин шляхом фрагментації ДНК останніх.