Газета «Новости медицины и фармации» Гастроэнтерология (429) 2012 (тематический номер)

Неспецифический язвенный колит (НЯК) и болезнь Крона (БК) являются полиэтиологическими заболеваниями, в возникновении которых значительную роль играет наследственная предрасположенность, реализующаяся под воздействием стрессов, пищевых погрешностей и кишечных инфекций посредством иммунологических нарушений. Микрофлора толстой кишки является одним из факторов, определяющих нормальное функционирование слизистого барьера кишечника [1, 2]. Бактерии толстого кишечника обеспечивают метаболическую и секреторную активность клеток кишечного эпителия, резистентность слизистых барьеров, реакции местного иммунного ответа [3, 4]. Кишечная палочка и бифидобактерии выполняют витаминообразующую функцию, способствуют синтезу незаменимых аминокислот, принимающих непосредственное участие в процессах регенерации слизистой кишечника [2, 5]. Облигатная микрофлора кишечника способствует синтезу муцинов. Муцины, в свою очередь, являются трофическим, энергетическим сырьем для жизнедеятельности бактерий, формирования колонизационной резистент­ности.

Дисбиотические процессы в толстом кишечнике непосредственно влияют на изменения мукозного слоя слизистой оболочки толстого кишечника [1, 5]. При изменениях микробиоценоза кишечника изменяются энергообеспечение колоноцитов и их трофика [5, 6]. При этом нарушается секреторная функция бокаловидных клеток, снижается синтез муцинов, изменяются их состав и свойства, нарушаются соотношения сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов, что приводит к нарушению защитных свойств слизи и поддерживает дисбиоз.

Вследствие нарушения хотя бы одного из компонентов слизистого барьера кишечника возникает феномен повышенной кишечной проницае­мости и кишечник становится источником поступления в организм большого количества антигенов, токсических со­единений. Воспалительный процесс в кишечнике, вызванный патогенной флорой, ксенобиотиками или аллергенами, стимулирует клетки иммунной системы и поддерживает системный воспалительный процесс. Подтверждением важной роли слизистого барьера кишечника является уменьшение активности заболевания у больных воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) после восстановления микробиоценоза кишечника и уменьшения кишечной проницаемости [4, 6].

Характер изменения слизистого барьера кишечника различается при различных типах ВЗК. Для больных НЯК характерен дисбиоз со снижением количества бифидобактерий и лактобацилл, облигатной флоры и увеличением факультативных бактерий [2, 4, 5], при этом определяется дефицит защитного слоя муцинов [4].  При болезни Крона наблюдается нарушение микробиоценоза толстого кишечника за счет микобактерий, псевдомонад, иерсиний, патогенных штаммов эшерихий [1, 4, 6] с избытком слизеобразования [4].  Одной из причин, определяющих различия в патогенезе изменений свойств кишечного барьера при НЯК и БК, может быть генетическая предрасположенность к восприятию антигенной нагрузки в кишечнике.

Определена локализация генов, ответственных за развитие ВЗК. Наиболее значимые находятся на 16, 22, 10, 2 и 19­й хромосомах. Генетическую предрасположенность к ВЗК связывают с полиморфизмом генов NOD2/CARD15, DLG5, TNF, TLR4, IL­1, IL­10. В нескольких исследованиях было установлено, что домен CARD15, расположенный на 16­й хромосоме и кодирующий белок NOD2, приводит к модификации иммунного ответа, изменяет проницаемость слизистого барьера кишечника и достаточно часто выявляется у пациентов с ВЗК, обусловливая тяжелое течение заболевания [10, 12]. Полиморфизм DLG5 также способствует развитию ВЗК, преимущественно БК.

В последнее время особое внимание уделяется генам, кодирующим синтез фактора некроза опухолей (TNF­a) и антагониста рецепторов интерлейкина­1 (IL­1). Выявлен выраженный полиморфизм гена, находящегося на второй хромосоме и определяющего уровень антагониста рецепторов к IL­1 в слизистой оболочке толстой кишки при НЯК, который стимулирует активность Т­ и В­лимфоцитов и индуцирует иммунный ответ. В то же время полиморфизм группы генов, определяющих уровень TNF­a, более характерен для пациентов с болезнью Крона [16].

В настоящее время особое внимание уделяется сис­теме толл­подобных рецепторов (TLRs 1­13), отвечающих за распознавание компонентов клеточной стенки бактерий, активацию каскада провоспалительных цитокинов и интерлейкинов, формирование колонизационной резистентности и бактериальную транслокацию [7–9]. TLRs в большом количестве представлены на поверхности кишечного эпителия, а также обнаружены в моноцитах, макрофагах, в системной циркуляции и периферических органах и тканях, что свидетельствует о важной роли толл­подобных рецепторов в регуляции как местного, так и системного иммунного ответа [7, 9]. Толл­подобные рецепторы активируются различными бактериальными или вирусными клеточными компонентами. Рецепторы распознают микробные структуры, так называемый патоген­ассоциированный микробный паттерн, и являются ключевым звеном в регуляции противомикробной протекции кишечника. Связывание рецепторов с бактериальным или вирусным антигеном приводит к активации факторов ядерной транскрипции (NF­kB, JAK2), изменению экспрессии провоспалительных цитокинов и индукции воспалительного ответа [7–10]. Повышенная экспрессия TLRs способствует активации цитокинов и интерлейкинов, избыточной продукции TNF­a, IL­1b, IL­6, IL­8 [10, 11]. Точечная мутация в экзоне гена TLR4 (хромосома 9q32–33) приводит к замене аспарагиновой кислоты на глициновую, потере отрицательного заряда в позиции 299 (Asp299Gly), что нарушает распознавание липополисахаридов бактерий, как in vitro, так и in vivo, и развитию грамотрицательного сепсиса у животных, снижению ответа на бактериальный эндотоксин в эксперименте у человека [7, 12]. TLR4 экспрессируется не только в кишечнике, но и в кардио­миоцитах, в головном мозге, лейкоцитах периферической крови [1, 7]. Изменение его экспрессии может быть обусловлено как внешними факторами, так и генетической предрасположенностью, что может влиять на характер иммунного ответа у пациентов с ВЗК [12–14]. В то же время TLR3 экспрессируется только на дендритных клетках [8, 13, 14, 16], следовательно, может являться первичным звеном, контактирующим с антигеном, распознающим и презентирующим компонентом иммунной системы кишечника.

В эксперименте клетки TLR3­дефицитных мышей характеризовались сниженной продукцией TNF­a, IL­6, IL­12 и нормальным ответом на бактериальные полисахариды [11, 15, 17]. Возможно, различные нарушения экс­прессии TLRs в кишечнике вследствие генетической предрасположенности способствуют формированию различных типов ответа на вирусные и бактериальные антигены, изменения качественного и количественного состава кишечной микрофлоры. Поэтому изучение ассоциаций нарушений микрофлоры кишечника в сочетании с анализом мутаций TLRs у пациентов с ВЗК представляется актуальным.

Целью данного исследования были оценка изменений качественного и количественного состава кишечной флоры у больных ВЗК, анализ генетической предрасположенности к нарушению иммунного ответа при дисбиотических процессах в толстом кишечнике у пациентов с НЯК и БК.

Материалы и методы

Было обследовано 92 пациента с ВЗК. Среди обследованных было 54 (58,7 %) больных НЯК и 38 (41,3 %) пациентов с болезнью Крона. Всем больным была проведена ДНК­диагностика в отделе молекулярно­генетических исследований ЦНИЛ ДонНМУ им. М. Горького, включавшая анализ мутаций толл­подобного рецептора 3 (мутация Phe412Leu) и толл­подобного рецептора 4 (мутация Asp299Gly). ДНК выделена из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента ДНК­экспресс­кровь. В работе были использованы диагностические тест­системы «SNP­экс­пресс», разработанные НПФ «Литех».

Анализ полиморфных ДНК­локусов осуществляли методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующей электрофоретической детекцией. Реакция проводилась при следующих условиях: первичная денатурация при 93 °С в течение 1 мин, после которой следовали 35 циклов, состоящих из денатурации при 93 °С в течение 10 с, отжига праймеров при 64 °С в течение 10 с, элонгации при 72 °С в течение 20 с. ПЦР проводили на амплификаторе Gene Amp^® PCR System 2400 (Applied Biosystems). Анализ амплифицированных фрагментов производили путем электрофореза в 3% агарозном геле, окрашенном в бромистом этидии. Визуализацию результатов проводили в ультрафиолетовом трансиллюминаторе TFX­20.M (Vilber Lourmat, Франция).

Для оценки изменений кишечного микробиоценоза проводили изучение облигатной и факультативной кишечной флоры, ее количественного и качественного состава. Забор кала проводился утром в стерильную посуду и в течение 1 часа доставлялся в микробиологическую лабораторию. Определяли количество бифидобактерий и лактобацилл, кишечной палочки; изучали количественный и качественный состав факультативной флоры с исследованием количества стафило­, стрепто­ и энтерококков, клебсиелл, протея, энтеробактера, цитобактера, грибов рода Candida. Помимо определения количества микроорганизмов изуча­ли их ферментативные свойства.

Результаты исследования и их обсуждение

Полиморфизм TLR3, TLR4 наблюдался более чем у половины обследованных больных ВЗК — 60 (65,2 %). Мутация TLR3 (Phe412Leu) встречалась чаще, чем TLR4, и отмечалась у 37 (41,1 %) больных ВЗК. Преобладающее количество мутаций были гетерозиготными. Полные мутации (Leu/Leu) были отмечены только у 6 (16,2 %) обследованных пациентов с ВЗК.

Частота встречаемости точечной мутации TLR3 различалась в зависимости от типа ВЗК. Гетерозиготные мутации (Phe/Leu) преобладали среди больных НЯК — 24 (64,9 %). Неполные мутации встречались с меньшей частотой при БК — 13 (35,1 %) пациентов. Гомозиготные мутации TLR3 (Leu/Leu) также преобладали среди пациентов с НЯК — 4 (10,8 %) по сравнению с больными БК — 2 (5,4 %), однако данные различия не были достоверными. Таким образом, полиморфизм TLR3 чаще наблюдался у больных НЯК, что может свидетельствовать о преобладании избыточного ответа на бактериальные полисахариды как облигатной, так и факультативной микрофлоры кишечника, запускающего каскад провоспалительных цитокинов (TNF­a, IL­6, IL­12), играющих ключевую роль в формировании ВЗК.

Мутация TLR4 (Asp299Gly) у обследованных больных наблюдалась несколько реже, чем TLR3, и встречалась только у 23 (25,0 %) пациентов с ВЗК. У всех больных отмечались только гетерозиготные мутации TLR4 (Asp/Gly). Полиморфизм TLR4 превалировал у больных БК — 15 (65,2 %) в отличие от больных НЯК, среди которых данная мутация наблюдалась лишь у 8 (34,8 %) пациентов. Следовательно, снижение или отсутствие способности адекватного распознавания бактериальных липополисахаридов вследствие мутации TLR4 более характерно для больных БК. Это приводит к снижению ответа на бактериальный эндотоксин грам­отрицательной флоры, индукции и хронизации воспалительного процесса в кишечнике. Возможно, это объясняет тот факт, что нарушение микробиоценоза толстого кишечника за счет патогенной микрофлоры, кишечные инфекции предшествуют развитию, а также провоцируют обострения у пациентов с болезнью Крона чаще, чем у больных НЯК.

Генетическая предрасположенность с сочетанной мутацией TLR3 и TLR4 наблюдалась только у 9 (9,8 %) больных ВЗК. При этом сочетанные мутации встречались с равной частотой у больных как НЯК, так и БК, что, возможно, связано с небольшим количеством наблюдений.

У всех 92 больных ВЗК были выявлены изменения количества и состава кишечной микрофлоры (табл. 1). При этом у больных как НЯК, так и БК не определялись патогенные микроорганизмы, а облигатная флора — бифидобактерии, лактобациллы и кишечная палочка — высевались почти у всех пациентов, однако их количество было значительно снижено. У пациентов с БК частота высеваемости E.coli была ниже — 30 (78,9 %), чем у здоровых лиц, причем как ее общего количества, так и кишечной палочки со слабо выраженными ферментативными свойствами за счет увеличения удельного веса гемолизирующей E.coli (до 50 %). У больных НЯК отмечалось только снижение количества кишечной палочки (6,75 ± 0,61). Энтерококки были выделены лишь у 63 (65,6 %) пациентов с НЯК (P < 0,05), а у пациентов с БК отмечалось снижение количества энтерококков (5,30 ± 0,51) при 100% высеваемости.

 Снижение количества облигатной флоры приводило к понижению колонизационной резистентности и росту факультативных бактерий. Энтеробактер у больных НЯК высевался достоверно чаще, чем у здоровых (40,8 и 24,0 % соответственно, P < 0,01), при этом его количество также достоверно превышало показатели здоровых лиц. Частота встречаемости стафилококков у больных НЯК была выше (52,6 %), чем у здоровых лиц, однако их количество достоверно не отличалось, при этом чаще высевались S.epidermidis, S.aureus. У пациентов с БК частота встречаемости стафилококков была значительно ниже — 5 (13,2 %), чем у здоровых (P < 0,03), а также пациентов с НЯК (P < 0,01). Клебсиеллы высевались достоверно чаще у больных НЯК — 39 (40,6 %), при этом их количество превышало норму в 2,7 раза. У больных БК высеваемость клебсиелл была достоверно ниже — 7 (18,2 %), однако их количество превышало норму (3,05 ± 0,61 lg КОЕ/г) и достоверно не отличалось от показателей больных НЯК. Частота высеваемости протея у больных НЯК была выше в 2 раза, а у больных БК — в 3 раза, чем у здоровых лиц. Протей был выделен у 38 (39,6 %) пациентов с НЯК, и его количество — 2,12 ± 0,22 lg КОЕ/г — значительно превышало норму — 0,48 ± 0,19 lg КОЕ/г (P < 0,001). Чаще высевался протей рода P.mirabilis. У 18 (47,4 %) пациентов с БК был выявлен протей, причем его количество также превышало допустимые значения (2,43 ± 0,27). У пациентов с БК чаще высевался P.vulgaris. Цитобактер не определялся у пациентов с БК и был выявлен только у больных НЯК — 50 (52,1 %) пациентов (P < 0,05), его количество достоверно превышало нормальные показатели (3,12 ± 0,22 и 1,79 ± 0,32 lg КОЕ/г соответственно (P < 0,05)). Грибы вида Candida у больных НЯК высевались чаще, чем у больных БК, однако их количество при БК несколько превышало нормальные показатели (4,28 ± 0,45). Следовательно, на фоне снижения количества облигатных бактерий у больных НЯК повышается количество, удельный вес факультативной флоры, что приводит к нарушению колонизационной резистентности. Повышается частота высеваемости клебсиелл, клостридий, энтеробактера и протея.

Наличие полиморфизма TLR3 и TLR4 у обследованных больных ВЗК приводило к более выраженным изменениям качественного и количественного состава микрофлоры кишечника по сравнению с больными, не имеющими генетической предрасположенности. Так, у пациентов с полиморфизмом TLR3 чаще высевались E.coli и Enterobacter, а у больных с полиморфизмом TLR4 преобладала высеваемость Klebsiella, Proteus и Enterococcus.

Выводы

Таким образом, у обследованных больных ВЗК имелась генетическая предрасположенность к нарушению микробиоценоза кишечника, связанная с изменением экспрессии толл­подобных рецепторов (TLR3 и TLR4). При этом сочетание полиморфизма TLR3 с изменениями микрофлоры кишечника свидетельствует о преобладании избыточного иммунного ответа на антигены облигатных и факультативных бактерий у больных НЯК. В то же время у пациентов с БК преобладание полиморфизма TLR4 в сочетании с наличием условно­патогенной микрофлоры в кишечнике может отражать снижение реактивности к кишечным патогенам.