Журнал «Медико-социальные проблемы семьи» 3 (том 18) 2013

Имплантация бластоцисты является абсолютным условием воспроизведения человеческого вида. Сложность этого процесса обусловлена, с одной стороны, тем, что эмбрион является наполовину чужеродным для материнского организма и представляет собой полуаллогенный трансплантат, с другой — тем, что восприимчивость эндометрия женщины к имплантации бластоцисты ограничена коротким временным промежутком — окном имплантации.

Процесс имплантации можно разделить на четыре этапа: аппозиция, адгезия, инвазия и васкуляризация. В человеческом виде успешность репродукции ограничена. Даже в клиниках IVF, где вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) используются для лечения бесплодия, имплантация является ограничивающим фактором. Для успешной имплантации эмбрион должен достичь стадии бластоцисты в момент рецептивной стадии развития эндометрия. Двунаправленная связь между эмбрионом и эндометрием обеспечивается молекулами адгезии, цитокинами, клетками иммунной системы.

Механизмы толерантности местного эндометриального иммунитета матери к полуаллогенному эмбриону до конца не изучены. Клетки трофобласта не экспрессируют классические антигены (молекулы А и В), но экспрессируют классические С и неклассические молекулы G I класса большого комплекса HLA­гистосовместимости.

В процесс имплантации вовлечены маточные натуральные клетки­киллеры, дендритные и регуляторные Т­клетки.

Несмотря на все усилия репродуктологов, по причинам, которые не достаточно хорошо изучены, не все бластоцисты имплантируются. Самая высокая частота имплантации высококачественной бластоцисты в программе ВРТ составляет около 60 %.

Известно, что контролируемая овариальная стимуляция (КОС) может привести к снижению рецептивности эндометрия. В частности, возможно прежде­временное созревание эндометрия и его асинхронное развитие по отношению к эмбриону, развивающемуся in vitro. Эмбрионы можно криоконсервировать для того, чтобы выполнить эмбриотрансфер в естественном цикле с более адекватной восприимчивостью эндометрия. Кроме того, известно, что очаговые травмы эндометрия могут улучшить исход ЭКО, что вызвано активацией репаративных процессов и местной воспалительной реакцией. Наконец, в модели имплантации in vitro было показано, что рецептивный эндометрий способен проводить селекцию и отклонять некомпетентные эмбрионы. Этот процесс может быть нарушен у пациенток с привычными неэффективными имплантациями и невынашиванием беременности.

Основная причина отсутствия имплантации — низкое качество эмбрионов, которое проявляется фрагментацией, задержкой развития, мультинуклеарными и хромосомными нарушениями.

На протяжении последних десятилетий многочисленные усилия были направлены на улучшение результативности ВРТ путем оптимизации условий культивирования эмбрионов. Стратегия селективного эмбриотрансфера для профилактики многоплодной беременности побудила эмбриологов искать дополнительную информацию об имплантационном потенциале эмбрионов.

Это было достигнуто путем удлинения культивирования эмбрионов до стадии бластоцисты, морфологической оценки качества эмбрионов методом time lapse, улучшения метаболизма фолликулярной жидкости и культуральных сред, предымплантационной генетической диагностики (ПГД). Однако по­прежнему актуальна необходимость проспективного рандомизированного контролируемого исследования для подтверждения этих рекомендаций и улучшения качества отбора эмбрионов [1].

Качество ооцитов играет решающую роль в формировании компетентных эмбрионов и, следовательно, результативности IVF. Состояние ооцитов зависит не только от ядерного и митохондриального генома, но и от микросреды яичника и предовуляторного фолликула, которая влияет на транскрипцию и трансляцию и, как следствие, на зрелость цитоплазмы.

В отличие от естественного цикла применение КОС обходит сложную процедуру селекции и допускает созревание большого количества ооцитов, часто низкого качества.

У зрелых ооцитов коронарно­ооцитарный клеточный комплекс (КОКК) расширен, имеет вид «пушистого облака» благодаря активной секреции гиалуроновой кислоты (рис. 1).

В циклах КОС созревание яйцеклетки и КОКК может быть асинхронным. Это обусловлено различной чувствительностью ооцитов и коронарной клеточной массы к препаратам [2].

Оценка ооцита после удаления КОКК при подготовке к ICSI является более информативной и основывается на оценке зрелости ядра, морфологии цитоплазмы, внешнего вида экстрацитоплазматических структур. Наличие первого полярного тельца (PBI) обычно считается маркером зрелости ядра ооцита [3] и его соответствия стадии метафазы II (MII) (рис. 2).

Для последующего оплодотворения созревание ядра и цитоплазмы должно быть скоординированным. Идеальный зрелый ооцит должен иметь нормальную на вид цитоплазму, одно полярное тельце, адекватную толщину блестящей оболочки (zona pellucida) и перивителлинового пространства (ПВП) [4]. Однако большинство ооцитов после КОС имеют те или иные отклонения от описанных идеальных морфологических критериев [5–10]. Это также верно для ооцитов, полученных от проверенных фертильных доноров ооцитов [11]. Морфологические критерии часто не в состоянии прогнозировать способность ооцитов к оплодотворению [10]. Только несколько морфологических характеристик ооцита МII указывают на нарушение способности к оплодотворению [12].

В большинстве случаев после КОС получают зрелые ооциты на стадии MII, хотя вполне возможно получение незрелых ооцитов в стадии зародышевого пузырька или метафазы I (MI).

Удаление клеточной массы кумулюса и короны дает уникальную возможность оценить морфологию ооцитов до оплодотворения и, в частности, степень созревания ядра.

Стадия MII характеризуется выстраиванием гомологичных хромосом на экваторе на протяжении метафазы второго мейотического деления. Общепризнанно, что 85 % ооцитов, полученных при КОС, имеют PBI и рассматриваются как стадия MII. В то же время 10 % ооцитов, полученных при КОС, представлены интрацитоплазматическим ядром, именуемым зародышевым пузырьком (GV), характерным для профазы I первого мейотического деления. Ооциты, полученные на этой стадии, в процесс оплодотворения не включаются (рис. 3).

Для качественного оплодотворения важно также состояние цитоплазмы, блестящей оболочки, перивителлинового пространства (рис. 4).

Для успешного оплодотворения и импланатации большое значение имеют толщина и структура блестящей оболочки (рис. 5, 6)[14, 15].

Во многих работах отмечается, что приблизительно треть всех яйцеклеток имеет увеличение перивителлинового пространства. Выявленный дисморфизм отрицательно коррелирует со скоростью оплодотворения и качеством эмбрионов [3, 6]. По мнению большинства авторов, увеличение ПВП (рис. 7–9) — признак перезревания яйцеклетки [8, 16]. Большое ПВП может возникнуть, если большая часть цитоплазмы экспульсируется совместно с гаплоидным хромосомным набором при формировании первого полярного тельца. Это приводит к образованию большого первого полярного тельца и, как следствие, большого ПВП.

Как правило, морфологию первого полярного тельца можно рассматривать как побочный продукт мейоза и отражение овуляторного возраста ооцитов. Тем не менее влияние морфологии РВI на результаты оплодотворения все еще является предметом для дискуссий. Ооциты с неповрежденным (интактным) полярным тельцем (рис. 10) имеют более высокую частоту имплантации и беременности [15], что, вероятно, связано с более высокой частотой формирования бластоцисты.

Доказано, что ооцит с гигантским полярным тельцем (рис. 11, 12) имеет очень плохой прогноз [16], так как в этом случае значительно чаще формируются эмбрионы с многоядерными бластомерами.

Иногда бывает трудно различить фрагментированные полярные тельца и клеточные фрагменты в ПВП (рис. 13–16). Качество эмбрионов не зависит от наличия грубых гранул в ПВП. Тем не менее это влияет на темпы имплантации и частоту беременности [17–19]. Грануляции в ПВП связаны с перезреванием ооцитов [18, 19].

В научных публикациях последних лет подчеркивается, что оптимальное число полученных ооцитов на пункцию — 15. Это количество ооцитов предоставляет возможность эффективного культивирования до стадии бластоцисты в случае необходимости проведения ПГД и криоконсервации избыточных эмбрионов.

Цель исследования: оценка эмбрионального фактора у пациенток с эффективным и неэффективным первым циклом ВРТ.

Материалы и методы

Проведен ретроспективный рандомизированный анализ 82 первых циклов IVF (40 эффективных — группа І, 42 неэффективных — группа ІІ).

Критерии включения: первый цикл ВРТ, отсутствие противопоказаний к ВРТ и беременности. В цикле, предшествовавшем IVF­ICSI, изучен иммунный статус женщин, определен уровень антимюллерова гормона (АМГ), ФСГ, проведен подсчет антральных фолликулов (АФ) на 2–3­й день менструального цикла (МЦ), пайпель­биопсия эндометрия с последующим морфологическим и иммуногистохимическим исследованием биоптата. Пациенткам обеих групп проведена КОС по классическому длинному протоколу.

Результаты и обсуждение

Средний возраст пациенток I группы составил 32,74 ± 0,92 года, II группы — 32,13 ± 0,77 года (р > 0,05). Рост пациенток с эффективным циклом — 165,54 ± 1,00 см, с неэффективным — 164,90 ± 1,09 см (р > 0,05); масса — 65,54 ± 1,86 кг и 67,65 ± 2,00 кг соответственно (р > 0,05); МРИ — 23,97 ± 0,69 и 24,89 ± 0,71 (р > 0,05). Возраст менархе — 13,29 ± 0,23 и 13,12 ± 0,25 года соответственно (р > 0,05). Менархе после 15 лет — у 8,57 ± 0,50 % и 7,89 ± 0,46 % пациенток (р > 0,05). У пациенток с первым неэффективным циклом продолжительность МЦ была достоверно меньше, что является одним из признаков снижения овариального резерва (ОР): 28,35 ± 0,24 дня в I группе и 26,39 ± 0,87 дня во II группе (р < 0,05). Нарушение МЦ было отмечено у 18,42 ± 0,70 % пациенток с эффективным циклом и у 19,51 ± 0,70 % — с неэффективным (р > 0,05).

Продолжительность периода бесплодия была ниже в группе с первым эффективным циклом — 5,68 ± 0,72 и 7,28 ± 0,67 года, но эта разница была недостоверной. Первичное бесплодие было у 48,72 ± 1,13 % пациенток с эффективным циклом и у 43,90 ± 1,05 % — с неэффективным, вторичное — у 51,28 ± 1,16 % и 56,10 ± 1,18 % соответственно (р > 0,05).

В группе пациенток с эффективным циклом на одну больную в анамнезе приходилось 0,95 ± 0,22 беременности, с неэффективным — 0,51 ± 0,10 (р > 0,07).

Роды в анамнезе были у 10,26 ± 0,52 % женщин первой группы и у 9,76 ± 0,49 % — второй (р > 0,05). От одного до четырех искусственных абортов в анамнезе было у 25,64 ± 0,82 % пациенток первой группы и у 14,63 ± 0,60 % — второй (р > 0,05). От одного до пяти самопроизвольных абортов в анамнезе — у 7,69 ± 0,45 % и у 9,76 ± 0,49 % пациенток соответственно (р > 0,05). У женщин с неэффективным циклом достоверно чаще наблюдались замершие беременности в анамнезе. От 1 до 3 замерших беременностей было у 5,13 ± 0,37 % пациенток с эффективным циклом и у 19,51 ± 0,70 % — с неэффективным (р < 0,05).

Диагностированный эндометрит и/или реабразия после прерывания беременности были у 10,26 ± 0,52 % пациенток с эффективным циклом и у 9,76 ± 0,49 % — с неэффективным (р > 0,05). Внематочная беременность отмечалась у 17,95 ± 0,69 % пациенток первой группы и у 21,95 ± 0,74 % — второй (р > 0,05). У пациенток с неэффективным первым циклом чаще наблюдался эндокринный фактор бесплодия — 58,97 ± 1,24 % и78,05 ± 1,39 % соответственно (р < 0,07). Снижение ОР было у 28,21 ± 0,86 % пациенток с эффективным циклом и у 51,22 ± 1,13 % — с неэффективным (р < 0,05). У пациенток с неэффективным циклом достоверно чаще наблюдался иммунологический фактор бесплодия — 28,95 ± 0,88 % и 80,49 ± 1,41 % соответственно (р < 0,05).

Эндометриоз был одним из факторов бесплодия у 12,82 ± 0,58 % пациенток с эффективным циклом и у 48,78 ± 1,10 % — с неэффективным (р < 0,05). Трубно­перитонеальная форма бесплодия была у 64,10 ± 1,29 % пациенток I группы и у 75,61 ± 1,37 % пациенток II группы (р > 0,05). Удаление маточных труб по поводу гидросальпинксов было произведено у 25,64 ± 0,82 % пациенток с эффективным циклом и у 34,15±0,92 % — с отсутствием беременности (р > 0,05).

У пациенток с неэффективным циклом достоверно чаще были выполнены оперативные вмешательства на органах малого таза: 52,63 ± 1,19 % пациенток с эффективным циклом и 80,49 ± 1,41 % — с отсутствием беременности (р < 0,05).

Количество оперативных вмешательств на одну женщину у пациенток с эффективным циклом составило 0,64 ± 0,13, с неэффективным — 1,40 ± 0,20 (р < 0,05). Мужской фактор бесплодия чаще был у пар с первой неэффективной попыткой, но эта разница была недостоверной — 53,85 ± 1,19 % и 63,41 ± 1,26 % соответственно (р > 0,05).

Маточный фактор бесплодия (гипоплазия, гиперплазия эндометрия, дисхроноз развития желез и стромы; хронический эндометрит; хронологические, количественные и качественные отклонения формирования пиноподий) наблюдался у 51,28 % пациенток с эффективным циклом ВРТ и у 87,80 % — с неэффективным (р < 0,05).

Протокол IVF­ICSI был проведен у 84,62 ± 1,49 % пациенток с эффективным циклом и у 82,93 ± 1,43 % — с неэффективным (р > 0,05). Трансфер криоэмбрионов был недостоверно чаще в группе с неэффективным циклом — 4,88 ± 0,35 % и 2,56 ± 0,26 % соответственно (р > 0,05). Цикл с донацией ооцитов чаще проводился у пациенток с эффективным циклом, однако эта разница была недостоверной — 15,38 ± 0,64 % и 4,88 ± 0,35 % соответственно (р > 0,05). В группе с первым эффективным циклом на одну пункцию было получено достоверно большее количество ооцитов по сравнению с женщинами с первым неэффективным циклом — 12,97 ± 0,99 и 8,24 ± 1,26 соответственно (р < 0,05). Число ооцитов МII на одну пункцию в группе с эффективным циклом — 9,83 ± 0,73, с неэффективным — 6,15 ± 0,78 (р < 0,05).

При проведении цикла IVF­ICSI у пациенток с эффективным циклом было получено достоверно больше зигот с двумя пронуклеусами по сравнению с женщинами с неэффективным циклом — 8,23 ± 0,63 и 4,76  ± 0,54 соответственно (р < 0,05).

В группе с первым эффективным циклом за 1 эмбриотрансфер было перенесено 2,60 ± 0,11 эмбриона, в группе с неэффективным циклом — 2,38 ± 0,15 (р > 0,05).

Успешное культивирование до стадии бластоцисты отмечалось у 95,00 ± 1,55 % пациенток с первым эффективным циклом и у 64,29 ± 1,25 % — с неэффективным (р < 0,05). Перенос топ­бластоцист был у 87,18 ± 1,51 % пациенток с первым эффективным циклом и у 46,34 ± 1,07 % — с неэффективным (р < 0,05).

Криоконсервация избыточных эмбрионов как показатель хорошего ОР, качества гамет и эмбрионов в цикле ВРТ была выполнена у 42,50 ± 1,04 % пациенток с эффективным циклом и у 23,81 ± 0,76 % — с неэффективным (р < 0,07).

Выводы

Проведенное исследование подтверждает важность имплантационного потенциала эмбрионов для эффективности цикла IVF. Необходимы дальнейшие исследования для улучшения методов культивирования эмбрионов, совершенствование оценки критериев качества эмбрионов для их селекции, улучшение метаболизма фолликулярной жидкости и культуральных сред, предымплантационной генетической диагностики.