Международный эндокринологический журнал 3(9) 2007

Введение

Тиреоидные гормоны трийодтиронин (Т3) и тироксин (Т4) имеют важное значение во многих процессах регуляции метаболизма. Ключевым ферментом биосинтеза Т4 и Т3 является тиреоидная пероксидаза (ТПО), которая катализирует две реакции: окисление ионорганического йодида (I–) и связывание йодированных тирозинов. Щитовидная железа (ЩЖ) является органом-мишенью при многих аутоиммунных заболеваниях (АЗЩЖ), таких как болезнь Грейвса, протекающая с тиреотоксикозом, и тиреоидит Хашимото, который приводит к гипотиреозу. Характерной особенностью этих заболеваний является потеря иммунологической толерантности к тиреоидной пероксидазе, а специфическим маркером этих заболеваний являются антитела к тиреоидной пероксидазе. Таким образом, помимо того что ТПО имеет важнейшую функцию в процессе синтеза тиреоидных гормонов, это еще и один из основных антигенов при аутоиммунных заболеваниях ЩЖ.

Экспрессия гена ТПО

Тиреоидная пероксидаза — ключевой фермент в процессе биосинтеза тиреоидных гормонов и один из трех главных антигенов при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы. Помимо ТПО, к ним относятся тирео­глобулин — основной компонент коллоида и рецептор ТТГ, который располагается на базальной мембране фолликулярных клеток ЩЖ. ТПО является гликозилированным трансмембранным белком 1-го типа, который локализуется в апикальной части фолликулярных клеток, где обычно осуществляются важнейшие этапы синтеза тиреоидных гормонов — окисление и органификация йода. ТПО катализирует окисление йода, йодирование остатков тирозина и соединение йодтирозинов с образованием йодтиронинов Т4 и Т3. Таким образом, ТПО играет ключевую роль в биосинтезе тиреоидных гормонов и необходима для нормального функционирования ЩЖ [1].

Ген ТПО человека локализуется на коротком плече хромосомы 2 и содержит 17 экзонов и 16 интронов общим объемом 16 килобаз [2, 3]. ДНК ТПО содержит 3048 пар оснований и кодирует белок, состоящий из 933 аминокислот, с крупным экстрацеллюлярным фрагментом, коротким одиночным трансмембранным сегментом и коротким цитоплазматическим хвостом [3]. Экспрессия ТПО находится под контролем специфических факторов транскрипции, таких как TTF-1, TTF-2 и PAX-8 [4, 5]. В начале были изолированы две матричные ДНК ТПО [2]: ТПО-1, которая кодирует полноцепочечный белок, и более короткая ТПО-2, кодирующая полипептид, в котором отсутствуют 57 аминокислотных остатков вследствие делеции 171-й пары оснований в экзоне 10. Кроме того, в фолликулярных клетках были идентифицированы фрагменты мРНК, образованные в результате альтернативного сплайсинга: ТПО-3 (экзон 16), ТПО-4 (экзон 14) и ТПО-5 (экзон 8) [6–8], а также мультисплайсинга: ТПО 2/3 (делеция экзонов 10 и 16), ТПО 2/4 (делеция экзонов 10 и 14) и ТПО-6 (делеция экзонов 10, 12, 13, 14 и 16) [7]. Среди всех изоформ ТПО только ТПО-1, ТПО?3 и ТПО-4 обладают ферментативной активностью [9, 10]. ТПО-2 неактивна, поскольку лишена способности связывать гем из-за отсутствия His 586 и Asn 579 [11]. Сплайсинговые варианты мРНК ТПО экспрессируются на различном уровне в нормальной ткани ЩЖ и при различной патологии, например при раке ЩЖ [2, 6–8, 12, 13]. Продукты транскрипции ТПО-2, ТПО-5 и мультисплайсинговых вариантов быстро деградируют, поскольку они не способны достичь клеточной поверхности, тогда как полипептиды ТПО-3 и ТПО-4 правильно встраиваются в апикальную мембрану, но ни физиологическое, ни патофизиологическое значение этих соединений неизвестно.

Структура белка ТПО

ТПО относится к суперсемейству пероксидаз животных (оксидоредуктазы, ЕС 1.7.1.11), семейству миелопероксидаз, которое, кроме того, включает миелопероксидазу гранулоцитов (МПО), лактопероксидазу (ЛПО), слюнную пероксидазу и пероксидазу эозинофилов (ЭПО) [14–19]. Сверка первичной структуры пероксидаз показала, что этим ферментам свойственен высокий уровень гомологии внутри одного семейства [20]. Аминокислотная последовательность ТПО человека в высокой степени сходна с ТПО свиньи, крысы и мыши за исключением вариации N- и С-концов [2, 21–24]. В эктодомене ТПО (остатки 1–848) присутствуют пять содержащих аспарагин потенциальных мест гликозилирования (Asn 129, 307, 342, 478, 569). Гликозилирование аспарагина 478 маловероятно, поскольку пролин присутствует в позиции Х в общей последовательности Asn-X-Thr [25]. В свиной молекуле ТПО на долю углеводов приходится около 10 % молекулярного веса, при этом только 4 из 5 потенциальных мест гликозилированы [26]. Экстрацеллюлярный С?конец ТПО по структуре гомологичен доменам белков контроля комплемента (БКК-подобный), C4b-b2 гликопротеину и эпидермальному ростовому фактору
(ЭРФ?подобный) [22].

Структурная гомология позволяет предположить, что молекула человеческого ТПО (чТПО) состоит из трех модулей, аналогичных миелопероксидазе (МПО-подобный), белкам контроля комплемента (БКК-подобный) и эпидермальному фактору роста (ЭРФ-подобный) [27]. С целью определения пространственной структуры трех фрагментов ТПО были получены ее кристаллы, но они оказались слишком малы для проведения кристаллографического анализа; самые большие кристаллы оказались способны преломлять рентгеновские лучи лишь с малым разрешением [28, 29]. По сравнению с другими ТПО первичная структура человеческого фермента (остатки 1–735) обладает наибольшим сходством (42 %) с МПО, что предполагает общее происхождение этих двух ферментов и схожесть их трехфрагментной пространственной структуры [20, 30]. Среди пероксидаз млекопитающих МПО является единственным ферментом, для которого выяснена его трехфрагментная структура [31, 32]. Представление об аналогичном строении ТПО как раз и базируется на структуре кристаллов МПО. Вторичная структура ТПО преимущественно состоит из a-спирали и в меньшей степени — из b-пластины [33].

Простетическая группа в каталитическом участке ТПО, содержащая гем, является производным ферропротопорфирина IX [34, 35]. В геме ТПО железо находится в форме FeIII. Оно реагирует с перекисью водорода (Н2О2), в результате чего образуется соединение I, содержащие на 2 электрона больше, чем ТПО в исходном состоянии. Два электрона переносятся с железа, в результате чего образуется оксиферрил (FeIV = 0) гем, а также с порфирина, в результате чего образуется порфирин-р-катион радикал. Гем связывает участок в центре основной части белка, где, так же как и в МПО и ЛПО, бис-гидроксилированный гем b ковалентно связан при помощи эфирных мостиков с остатками Glu 399 и Asp 238 [36, 37]. Проксимальными лигандами гема ТПО являются His 494 и Asn 579 (необходимы для достижения редокс-потенциала железа), а дистальными — His 239, Arg 396 и Gln 235 [38, 39]. Предполагается, что связи белка и гема формируются за счет механизма внутреннего процессинга. Ферментативно очищенная активная человеческая ТПО по данным электрофореза в SDS-полиактиламидном геле формирует плотно расположенные дублеты размером 105–110 кДа [40–42]. ТПО, синтезируемая на полисомах, поступает в эндоплазматический ретикулум, где происходит гликозилирование белкового ядра молекулы, после чего созревание фермента заканчивается в аппарате Гольджи.

Большая часть фермента обнаруживается на перинуклеарной мембране, в эндоплазматическом ретикулуме и во внутриклеточных везикулах. Этот пул внутриклеточной ТПО преимущественно имеет неправильную пространственную структуру и быстро распадается [43, 44]. Созревшая, с правильной структурой, ферментативно активная ТПО транспортируется к апикальному полюсу тироцитов. Там обнаруживается только 1,5–2 % от всей синтезированной ТПО [45].

Функция ТПО

ТПО является ключевым ферментом биосинтеза тиреоидных гормонов. Она катализирует две ферментативные реакции: йодирование остатков тирозина в тиреоглобулине (ТГ) и окислительное связывание моно- и дийодтирозинов с образованием Т4 и Т3, связанных с ТГ [46, 47]. Этот процесс происходит в области апикального полюса тироцитов, который обращен к просвету фолликула, где помимо этого локализуются и другие ферменты, вовлеченные в биосинтез тиреоидных гормонов [48, 49]. Эти отдельные, но одновременно катализируемые реакции не специфичны для ТПО, а характерны и для пероксидаз животных, таких как ЛПО и МПО [36, 50].

Для энзиматических реакций, осуществляемых ТПО, необходимы йод, Н2О2 и ТГ. Для того чтобы воздействовать как йодирующий агент, йодид, аккумулирующийся в тиреоците, в начале должен быть окислен. Эта реакция катализируется ТПО в присутствии Н2О2. Перекись водорода генерируется у апикального полюса тироцитов двойными оксидазами 1 и 2 (DUOX 1/2) — ферментами, принадлежащими к семейству НАДФ-Н оксидаз, которым необходимы НАДФ-Н и Са2+ [51–53].

Предполагается три возможных механизма, по которым осуществляется йодирование, катализируемое ТПО: свободнорадикальный механизм, ТПО-I+ — как промежуточный продукт или промежуточное йодирование с образованием гипойодита [54]. В последнем случае железо гема, входящего в ТПО, выступает в окисленной форме (ТПО-FeIII). FeIII окисляется Н2О2 с образованием каталитического промежуточного соединения I (Ep+.–FeIV = O порфирин-p-катион), содержащего оксиферрил-гем, и по сравнению с нативным ферментом — два дополнительных окислительных эквивалента [55–57]. Соединение I катализирует окисление двух электронов йодида с образованием ферментсвязанного гипойодида (E-OI–), который йодирует остатки тирозина в тиреоглобулине до моно- и дийодтирозина (МИТ, ДИТ) [58].

Второй реакцией, катализируемой ТПО, является связывание остатков йодтирозина с образованием тиреоидных гормонов T4 (DIT-DIT) и T3 (MIT-DIT) [59–61]. Эта реакция включается в окислительный этап и неокислительное связывание и этап декомпозиции [62]. В соответствии с этой предполагаемой моделью окисление одного электрона остатков йодтирозина продуцирует заряд, в итоге обеспечивающий связывание радикалов йодтирозина с образованием комплекса ТГ-Т4. Образование Т4 и Т3 зависит от нативной трехмерной структуры ТГ, поскольку оно происходит в результате специфической конформации пептидов, являющихся акцепторами и донорами остатков йодтирозина [63]. В результате реакции отщепления образуются тиреоидные гормоны и остатки дегидроаланина в донорских участках ТГ [64, 65]. Активная форма ТПО как для йодирования, так и для соединения йодтирозинов — наиболее вероятно p-катион I (ТПОp+ – FeIV = O).

Дефекты органификации йода, которые в тяжелых случаях приводят к гипотиреозу, могут быть результатом нарушения синтеза ТГ, синтеза ТПО или продукции Н2О2. Мутации гена ТПО, вероятно, являются одной из двух основных причин нарушения органификации йода. Редукция или полное отсутствие активности ТПО, которое может быть следствием снижения связывания гема или субстрата, а также неправильной локализации или подавления ферментативной активности, являются важными причинами врожденного гипотиреоза [66–69].

ТПО и аутоиммунные заболевания щитовидной железы

Аутоиммунные заболевания щитовидной железы являются наиболее распространенной органоспецифической аутоиммунной патологией, которая встречается примерно у 5 % населения во всем мире. К настоящему времени прошло уже 47 лет с тех пор, как были описаны антитела к антигену, отличающемуся от ТГ, — антигену микросомальной фракции ЩЖ [70]. Несмотря на проведение ряда исследований, природа микросомального антигена оставалась неизвестной почти 30 лет. Спустя много лет, в 1985 году, были получены первые данные о том, что микросомальным антигеном является ТПО [40, 71, 72].

ТПО, экспрессирующаяся на поверхности тироцита, является одним из основных антигенов ЩЖ, при этом предполагается, что аутоиммунная патология ЩЖ развивается вследствие направленной на ТПО агрессии как гуморального, так и клеточного звеньев иммунитета.

Антитела к ТПО (АТ-ТПО) являются маркером АЗЩЖ. Они присутствуют в сыворотке у большинства пациентов с болезнью Грейвса (80 %), тиреоидитом Хашимото (более 90 %), послеродовым тиреоидитом (2/3); их распространенность среди лиц без нарушения функции ЩЖ достигает 26 % [73–77]. АТ-ТПО преимущественно продуцируются В-лимфоцитами, инфильтрирующими ЩЖ, и их уровень отражает выраженность лимфоидной инфильтрации [78]. Аутоиммунный ответ к ТПО поликлонален, и циркулирующие АТ-ТПО преимущественно относятся к субклассам IgG 1 и IgG 4 с легкими k-цепями; тем не менее у тех же пациентов были обнаружены IgG 2 и IgG 3 с l-цепями [79, 80]. ТПО и АТ-ТПО вовлечены в комплементзависимую цитотоксичность и антителзависимые клеточно-опосредованные механизмы цитотоксичности, включающие NK-клетки [81–86]. Кроме того, было обнаружено, что ТПО может активировать каскад комплемента в несвязанном с антителами состоянии [87]. Наряду с этим было показано, что некоторые АТ-ТПО могут in vitro связывать ТПО и подавлять ее ферментную активность, хотя эти данные весьма противоречивы [88, 89]. Недавно было высказано предположение, что для оказания эффектов АТ-ТПО необходимо участие FcR — рецептора иммуноглобулина, экспрессируемого тироцитами, который участвует в трансцитозе IgG сквозь эпителий [90]. Аутоиммунные процессы в ЩЖ являются Т-лимфоцитзависимыми процессами. Эпитопы, которые распознаются Т-клетками,— короткие линейные пептиды, образующиеся при процессинге ТПО в антигенпрезентирующих клетках, которые после связывания с молекулами МНС II класса (CD4+ T-клетки) распознаются рецепторами Т-клеток. При использовании различных методов (синтетические пептиды, короткие пептиды бактериального происхождения) на молекуле ТПО, включая ее трансмембранный домен, были идентифицированы некоторые эпитопы для Т-клеток [91–93]. Несмотря на то что речь идет преимущественно об экспериментальных данных, они имеют большое значение, поскольку конкретный эпитоп ТПО, который задействован при АЗЩЖ, остается до конца неизвестен. Кроме того, в целом необходимо еще выяснить роль Т-клеток в инициации АЗЩЖ. Специфические антитела могут видоизменять Т-клеточную реакцию на ТПО при помощи модулирования презентации различных пептидов для Т-клеток [94].

ТПО как антиген

Поликлональные АТ-ТПО, присутствующие в сыворотке крови пациентов с АЗЩЖ, реагируют с некоторыми эпитопами В-клеток, локализованными на поверхности ТПО. Первое отграничение эпитопов ТПО было сделано в сравнительном эксперименте с человеческими АТ?ТПО и мышиными моноклональными АТ-ТПО, распознававшими эпитопы, расположенные на четырех доменах ТПО: A, B, C и D [95]. Эти пионерские исследования показали, что иммунодоминантный регион (ИДР) ТПО, распознаваемый антителами, ограничен участком, перекрывающим домены A и B [95]. Этот вывод был сделан позднее после того, как были проведены исследования с моноклональными человеческими антителами в форме Fab-фрагментов, продуцируемых В-лимфоцитами, инфильтрировавшими ЩЖ при болезни Грейвса и тирео­идите Хашимото [96, 97]. Оба региона, распознававшиеся человеческими моноклональными антителами, представляли собой одни и те же домены А и В [98]. Кроме того, незначительная часть линейно расположенных эпитопов, распознанных АТ-ТПО вне ИДР, включала домены С2 и С21 [99]. Было показано, что большая часть эпитопов, которые распознаются АТ-ТПО, конформационны, то есть зависят от третичной пространственной структуры и правильности складчатости молекулы ТПО [100, 101]. Точная локализация и структура прерывистого ИДР молекулы ТПО пока не выяснена. Недавние достаточно убедительные данные свидетельствуют о том, что ИДР ТПО ограничен МПО-подобным доменом [102, 103]. Влияние конформации ИДР ТПО было продемонстрировано в эксперименте с использованием человеческого Fabs и поликлональных антител против пептидов, которые могут экспрессироваться на поверхности человеческой АТ-ТПО [30, 104, 105]. Некоторые исследования идентифицировали фрагменты эпитопов ТПО и подтвердили переменчивую природу ИДР ТПО [106, 108]. Моделирование структуры ТПО на основании ее гомологии с МПО позволяет предсказать потенциальную поверхность антигенов ТПО. Так были идентифицированы пептиды, прилежащие к эпитопам, локализованным в МПО-подобных доменах ТПО: остатки 713–717, 599–617, 210–225, 353–363, 549–563 [27, 106–109]. Кроме того, было постулировано наличие в ИДР БКК-подобного и ЭРФ-подобного доменов [110]. ЭРФ-подобная порция ТПО была исключена, тогда как БКК-подобный модуль, вероятно, влияет на ИДР лишь неспецифично [110]. Недавние экспериментальные данные позволили предположить, что БКК-подобный модуль ТПО является одной из частей варьирующего ИДР ТПО [106, 111]. Фрагмент ТПО, участвующий в связывании АТ-ТПО, к настоящему времени идентифицирован (остатки 210–225, 353–363, 549–563, 599–617, 713–720 и 766–775) в доменах А и В ИДР, локализованных в МПО-подобном и БКК-подобном модулях. В целом эти данные свидетельствуют о прерывистой и сложной природе ИДР. В нативной структуре ТПО, МПО- и БКК-подобные модули, вероятно, расположены в близком соседстве, образуя поверхность, узнаваемую АТ-ТПО у большинства пациентов с АЗЩЖ. Изучение ИДР ТПО с использованием человеческих, мышиных и кроличьих антител позволило предположить, что ИДР (А и В) образует отдельный комплекс в молекуле ТПО, расположенный в области остатков 599–617, лежащий в МПО-подобном домене [108]. Это свидетельствует о том, что складчатая структура молекулы ТПО имеет очень высокую плотность и генерирует отдельную высококонформационную иммунодоминантную поверхность, к которой образуются АТ-ТПО. Несмотря на это, БКК-подобный (содержащий остаток Tyr 772) и ЭРФ-подобный модули вместе с петлевым регионом ТПО, вероятно, имеют важное значение для формирования трехмерной пространственной структуры, необходимой для связывания с антителами. Считается, что соотношение различных АТ-ТПО, направленных против отдельных эпитопов ИДР, не отражается на функции ЩЖ, сохраняется постоянным на протяжении длительного времени и детерминировано генетически [112–116].

Заключение