Газета «Новости медицины и фармации» №6 (758), 2021
Вернуться к номеру
Лабораторные платформы для определения адаптивного Т-клеточного иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2
Авторы: Мельник А.А.
к.б.н., продакт-менеджер, ООО «ЛАБИКС», г. Киев, Украина
Рубрики: Инфекционные заболевания
Версия для печати
В конце 2019 года в мире появился новый коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), вызывающий заболевание COVID-19. После того как новый патоген распространился по всему миру, ВОЗ объявила о пандемии 11 марта 2020 года [1]. Отсутствие ранее существовавшего иммунитета к этому новому вирусу связано с необычайным ростом заболевания. На момент написания статьи в мире зарегистрировано уже более 150 млн подтвержденных случаев инфицирования и около 3 млн смертей. Была предпринята беспрецедентная глобальная попытка охарактеризовать иммунный ответ на SARS-CoV-2, а также разработать и применить вакцины. Понимание закономерностей иммунитета на индивидуальном и популяционном уровнях будет ключом к решению задачи прекращения пандемии.
Для успеха в преодолении распространения вируса SARS-CoV-2 очень важное значение имеет надежность тестирования и гибкий подход к данному виду лабораторных исследований. На текущий момент пандемии COVID-19 очень важно исследовать силу и продолжительность иммунного ответа на вирус SARS-CoV-2. Понимание этих параметров критично для эпидемиологических прогнозов и оценки действия вакцины. Появляется все больше данных о том, что Т-клеточный ответ на вирус играет не меньшую роль, чем образование специфических антител. В то время как наблюдается быстро растущее количество литературы о реакции антител на SARS-CoV-2, гораздо меньше опубликовано информации о Т-клетках, которые имеют решающее значение для противовирусного иммунитета. Исследования подтверждают, что эпидемиологические данные, основанные только на обнаружении антител к SARS-CoV-2, могут привести к существенной недооценке предшествующего воздействия вируса.
Иммунная система организма человека
Иммунная система организма человека состоит из врожденного (неспецифического) и приобретенного (специфического) иммунитета.
Под неспецифическим иммунитетом подразумевают систему предшествующих защитных факторов организма, присущих данному виду как наследственно обусловленное свойство. Так, первые антитела к различным инфекциям ребенок начинает получать, еще находясь в утробе матери, — через плаценту, а после рождения антитела поступают вместе с грудным молоком. Специфический иммунитет — это реакция организма, направленная на дифференциацию всего «своего» от всего «чужого». В понятие защиты от «чужого» входят представления о том, что специфический иммунитет проявляется всегда, когда конкретный организм вступает в контакт с тем или иным антигенно чужеродным материалом (микроорганизмы, трансплантаты, мутационно измененные собственные клетки и др.), которым приданы иммуногенные свойства. Существенным признаком специфического иммунитета является способность сохранять память о первой встрече с антигеном. Именно это свойство лежит в основе вакцинации.
Приобретенный (специфический, или адаптивный) иммунитет
Адаптивный (приобретенный, или специфический, иммунитет) отсутствует при рождении. Этот процесс узнавания и обучения начинается тогда, когда иммунная система сталкивается с чужеродными веществами (антигенами) и распознает их. Затем компоненты приобретенного иммунитета узнают, как лучше всего атаковать каждый антиген. Приобретенный иммунитет также называется специфическим иммунитетом, так как он адаптирует свою атаку на определенный ранее встреченный антиген. Его отличительной чертой является способность учиться, приспосабливаться и запоминать. Иммунная система может запомнить каждый встреченный антиген, потому что после столкновения некоторые лимфоциты превращаются в клетки памяти. Эти клетки живут долго — годами или даже десятилетиями. Когда клетки памяти сталкиваются с антигеном во второй раз, они немедленно распознают его и быстро реагируют на этот конкретный антиген. Такой специфический иммунный ответ является причиной того, что люди не заболевают корью или ветряной оспой более одного раза. Напротив, вирусы простуды или гриппа умеют «уходить от удара» за счет быстрой изменчивости, поэтому нельзя получить иммунитет против них раз и навсегда.
В табл. 1 представлена классификация клеток иммунной системы в соответствии с рецепторами на их мембране.
Как видно из табл. 1, лимфоциты могут быть Т-клетками или В-клетками, которые работают в организме вместе, чтобы уничтожить чужеродный антиген.
/12_u.jpg)
Т-клетки
Т-клетки происходят из стволовых клеток костного мозга, которые попадают в орган грудной клетки, называемый тимусом. Там они учатся отличать свои антигены от чужих, чтобы не атаковать собственные ткани организма. Обычно только Т-клетки, которые научились игнорировать собственные антигены (аутоантигены), созревают и покидают вилочковую железу. Т-клетки потенциально могут распознать почти неограниченное количество различных антигенов. Зрелые Т-клетки содержатся во вторичных лимфоидных органах (лимфатических узлах, селезенке, миндалинах, аппендиксе и пейеровых бляшках в слизистой оболочке тонкой кишки). Эти клетки циркулируют в кровотоке и лимфатической системе. После того как они впервые сталкиваются с инфицированной или аномальной клеткой, они активируются и ищут именно эти клетки. Обычно для активации Т-клеткам требуется помощь другой иммунной клетки, которая разбивает антигены на фрагменты (так называемый процессинг антигена), а затем представляет антиген из инфицированной или аномальной Т-клетки. Далее Т-клетки размножаются и специализируются в различные типы Т-клеток:
- киллерные (цитотоксические) Т-клетки прикрепляются к антигенам инфицированных или аномальных (например, раковых клеток). Т-киллеры убивают эти клетки, проделывая отверстие в их клеточной мембране и вводя в клетки ферменты;
- Т-хелперы помогают другим иммунным клеткам. Некоторые хелперные Т-клетки способствуют выработке В-клетками антител против чужеродных антигенов. Другие помогают активировать Т-киллеры для уничтожения инфицированных или аномальных клеток, а также активировать макрофаги;
- супрессорные (регуляторные) Т-клетки вырабатывают вещества, которые помогают остановить иммунный ответ или иногда предотвращают возникновение определенных нежелательных реакций.
Когда Т-клетки первоначально сталкиваются с антигеном, большинство из них выполняет предназначенную им функцию, но некоторые развиваются в клетки памяти, которые запоминают антиген и более энергично реагируют на него, когда сталкиваются с ним снова.
В-клетки
В-клетки образуются в костном мозге. Они имеют определенные участки (рецепторы) на своей поверхности, к которым могут прикрепиться антигены, и распознают почти неограниченное количество различных антигенов. Основная цель В-клеток — продуцировать антитела, которые маркируют антиген для атаки или напрямую его нейтрализуют.
Роль Т-клеток в иммунном ответе на вирус SARS-CoV-2
Т-клетки играют решающую роль в иммунном ответе на вирусные инфекции из-за их способности избирательно уничтожать инфицированные вирусом клетки [2, 3]. Недавние исследования на моделях трансгенных мышей подтвердили, что Т-клетки также важны для уничтожения вирусов и борьбы с заболеванием после заражения SARS-CoV-2 [4]. Следовательно, активация Т-клеток является признаком раннего специфического клеточного иммунного ответа на SARS-CoV-2 [5–9]. Генерация Т-клеток памяти может обеспечить пожизненную защиту от заражения. Предыдущие исследования показали, что Т-клетки, специфичные для SARS-CoV и MERS-CoV, можно обнаружить через много лет после инфицирования [10–13].
Механизм Т-клеточного иммунитета против SARS-CoV-2 представлен на рис. 1.
Как видно на рис. 1, CD8+ Т-клетки распознают вирусные антигены через их презентацию молекулами основного класса гистосовместимости I (MHC I) на инфицированных вирусом клетках, а также на неинфицированных дендритных клетках и макрофагах в лимфоузлах (процесс, известный как перекрестное представление). Как только Т-клетки активируются после распознавания антигена, они подвергаются процессу, называемому клональной экспансией, в котором активированные Т-клетки быстро пролиферируют с образованием большого количества Т-клеток с идентичными Т-клеточными рецепторами (TCR) и также распознают антиген. При элиминировании инфицированных вирусом клеток наблюдается увеличение клонов CD8+ Т-клеток с TCR, специфичными для вирусных антигенов. Этот процесс осуществляется путем их лизирования с высвобождением перфоринов/гранзимов, которые индуцируют апоптоз через лиганд, связанный с TNF-лигандом, индуцирующим апоптоз (TRAIL), или Fas-лигандом (апоптозный антиген 1), и секретируют провоспалительные медиаторы, такие как интерферон-γ (IFN-γ) [14–16].
Таким образом, Т-клетки являются решающими медиаторами противовирусного адаптивного иммунитета, и их анализ представляет огромный интерес и важность в контексте заболевания COVID-19.
Методы оценки Т-клеточного иммунного ответа на COVID-19 широко используются как для диагностики заболевания у пациентов с наличием симптомов, так и для определения общего количества людей, перенесших данное заболевание, в том числе бессимптомно. Данные тесты эффективны для оценки иммунного ответа после проведения вакцинации, а также для оценки напряженности специфического иммунитета в группах риска и у ранее переболевших. Кроме того, Т-клетки отвечают на попадание вируса в организм раньше, чем антитела, клеточный иммунитет обеспечивает долговременную защиту от коронавирусной инфекции. Одного только исследования на антитела недостаточно для комплексной защищенности от COVID-19 (рис. 2).
В настоящее время для определения адаптивного Т-клеточного иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 разработаны и успешно внедрены в практику такие методы, как ELISPOT и T-Detect Covid.
1. Метод ELISPOT
Среди методов оценки Т-клеточного иммунного ответа наиболее перспективным является IGRA-ELISPOT (Interferon-Gamma Release Assay — Enzyme Linked Spot Analysis, или секреция гамма-интерферона — иммуноферментный анализ пятен). Этот тест основан на выбросе гамма-интерферона под действием специфических антигенов коронавируса [17]. ELISPOT — чувствительный и надежный инструмент для измерения функционального отклика иммунитета путем оценки наличия антиген-специфических цитокин-секретирующих лимфоцитов. Данная технология впервые была применена для диагностики туберкулеза компанией Oxford Immunotec (Великобритания) и сейчас используется как один из методов оценки Т-клеточного иммунитета.
Набор T-SPOT Discovery SARS-CoV-2
Набор для анализа T-SPOT Discovery SARS-CoV-2 предназначен для обнаружения клеточного COVID-19 опосредованного иммунитета с использованием пулов пептидов из вируса SARS-CoV-2 (рис. 3).
/13_u.jpg)
Принцип анализа
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяют из образца цельной крови и промывают для удаления любых источников фона. PBMC включают лимфоциты (Т, В и NK-клетки), моноциты и дендритные клетки.
Затем PBMC подсчитываются таким образом, чтобы в анализе использовалось стандартное количество клеток. Это гарантирует, что в лунки для микротитрования будет добавлено адекватное количество образца с PBMC даже с низкими титрами Т-лимфоцитов в случае ослабленной иммунной системы (ослабленный иммунитет или иммуносупрессия).
Для каждого образца требуется шесть лунок:
1. Нулевой контроль для выявления неспецифической активации клеток.
2. COVID-19. Панель 1: панель специфических антигенов SARS-CoV-2.
3. COVID-19. Панель 3: панель специфических антигенов SARS-CoV-2.
4. COVID-19. Панель 4: панель специфических антигенов SARS-CoV-2.
5. COVID-19. Панель 13: панель, содержащая эпитопы SARS-CoV-2 с высокой степенью гомологии с эндемичными коронавирусами.
6. Положительный контроль: раствор митогена, содержащий фитогемагглютинин для подтверждения функциональности PBMC.
Анализ включает три панели специфических антигенов SARS-CoV-2, а также четвертую панель (панель 13), которая содержит пул эпитопов SARS-CoV-2 с высокой степенью гомологии к эндемичным коронавирусам. Панель 13 позволяет исследовать перекрестную реактивность к эндемичным штаммам коронавирусов.
Процедура анализа
1. Забор образца осуществляется с помощью стандартной флеботомии в пробирки для крови, из которой выделяют мононуклеарные клетки периферической крови. Клетки промывают, подсчитывают и нормализуют для создания стандартной клеточной суспензии.
2. Стандартное количество клеток добавляют в специальные планшеты и стимулируют антигенами, специфичными для изучаемого заболевания. Клетки, отвечающие на эти антигены, выделяют химический посредник, известный как цитокин.
3. Цитокиновые антитела используются для непосредственного захвата цитокина по мере его высвобождения клетками. Далее добавляется вторичное меченое антитело, которое связывается с захваченным цитокином.
4. Добавляется детекторный реагент, который вступает в реакцию со вторичным меченым антителом. В результате этой реакции образуются пятна, которые являются следствием высвобождения цитокина. Затем производится подсчет пятен (рис. 4).
/14_u.jpg)
В тесте подсчитываются эффекторные Т-клетки, реагирующие на стимуляцию с использованием двух отдельных пептидных пулов, измеренных параллельно в отдельных лунках. Панели антигенов T-SPOT COVID разработаны как перекрывающиеся пептиды, охватывающие последовательности белков Spike и Nucleocapsid. Этот дизайн предлагает максимальное покрытие эпитопа для более точного обнаружения реактивности Т-клеток. Антигенные препараты из 253 пептидов, покрывающие наиболее иммуногенные области вирусного генома, позволяют измерять широту иммунитета и сводят к минимуму влияние точечных мутаций. Специфичность к SARS-CoV-2 была увеличена за счет удаления потенциально перекрестно-реактивных пептидных последовательностей с высокой гомологией с другими коронавирусами.
Каждое пятно представляет собой след в виде отдельной цитокин-секретирующей Т-клетки. Производится подсчет количества полученных пятен, что показывает количество антиген-специфических эффекторных Т-клеток в периферической крови (рис. 5).
Интерпретация результатов
Результаты теста на Т-лимфоциты:
- > 8 пятен — реактивные Т-клетки;
- 5–7 пятен — пограничный;
- < 4 пятен — нереактивные Т-клетки.
Что означает результат теста «реактивные Т-клетки»?
У вас есть Т-клетки, которые реагируют на пептиды, специфичные для SARS-CoV-2, используемые в тесте. Весьма вероятно, что они подверглись воздействию вируса SARS-CoV-2.
Что означает результат теста «нереактивные Т-клетки»?
У вас нет Т-клеток, которые реагируют на пептиды, специфичные для SARS-CoV-2, используемые в тесте. Поэтому маловероятно, что они подверглись воздействию вируса SARS-CoV-2.
Результаты следует использовать вместе с информацией, полученной в результате клинической оценки и других диагностических процедур. Положительная корреляция с предыдущим положительным результатом полимеразной цепной реакции (ПЦР): 96,6 % < 60 дней, 83,3 % > 60 дней. Отрицательная корреляция с популяцией низкого риска: 98,0 %.
/14_u2.jpg)
2. T-Detect COVID
Тест T-Detect COVID — это анализ на основе мультиплексной ПЦР и секвенирования следующего поколения (NGS) для обнаружения и идентификации последовательностей гена реаранжированного Т-клеточного рецептора бета (TCR-β) из геномной ДНК человека (гДНК), выделенной из венозной цельной крови с использованием дикалия этилендиаминтетрауксусной кислоты (K2-EDTA) в качестве антикоагулянта. T-Detect COVID предназначен для использования в качестве средства идентификации людей с адаптивным Т-клеточным иммунным ответом на SARS-CoV-2 и указывает на недавнее или предшествующее заражение вирусом SARS-CoV-2.
Тестирование с помощью теста T-Detect COVID предназначено специально для использования квалифицированным клиническим лабораторным персоналом, который проинструктирован и обучен на работе использованию систем секвенирования Illumina NextSeq 500 и NextSeq 550 и рабочих процессов секвенирования нового поколения.
5 марта 2021 года FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) выдало разрешение на использование в экстренных случаях (EUA, Emergency Use Authorization, или разрешение на использование в экстренных ситуациях) для теста T-Detect COVID, разработанного компанией Adaptive Biotechnologies (США).
Принцип теста
T-Detect COVID Test — это целевой подход NGS, который устанавливает последовательность и количественно определяет реаранжированный TCR-β последовательности из гДНК, экстрагированной из цельной венозной крови. В анализе используется машинный алгоритм для выявления пациентов с иммунным ответом на SARS‑CoV‑2 на основе наблюдаемых перестроенных β-последовательностей TCR. Имеется база данных по перестроенным β-последовательностям TCR, связанных с пациентами, у которых они ранее были идентифицированы.
Выделение ДНК из образца крови выполняется с помощью системы Kingfisher Flex 711 и MagMax DNA. Наборы реагентов Ultra 2.0 для нескольких проб. Минимум 18 мкг гДНК извлекается из 2 мл крови. Геномная ДНК, выделенная из каждого биологического образца, разделяется на 4 реплики для реакционных лунок ПЦР. Поскольку известное количество синтетических молекул добавляется к каждой ПЦР, эти молекулы используются для расчета абсолютного количества последовательности TCR-β. Стратегия мультиплексной ПЦР используется при амплификации реаранжированных β-последовательностей TCR из гДНК, референсного локуса, синтетической β-молекулы TCR и синтетических референсных молекул (рис. 6).
Специфичный для COVID алгоритм (классификатор) применяется к результатам основного анализа каждого образца и генерирует COVID-положительный/отрицательный результат. Классификатор идентифицирует и количественно определяет любые SARS-CoV-2-связанные последовательности рецепторов Т-клеток из заранее определенного списка из нескольких тысяч SARS-CoV-2-связанных TCR, а также количественно определяет все уникальные идентифицированные TCR. Эти факторы математически оценивают последовательности β-TCR, связанные с SARS-CoV-2. Применяется пороговое значение, чтобы классифицировать образец пациента как положительный или отрицательный в плане иммунного ответа на SARS-CoV-2. Общее количество уникальных последовательностей TCR должно находиться в пределах порогового значения, чтобы алгоритм предоставил результат.
Интерпретация результатов
Перед интерпретацией результатов пациента следует проверить все контроли. Если контроли недействительны, результаты пациента не могут быть интерпретированы.
Интерпретация результатов для образцов пациентов представлена в табл. 2.
Таким образом, тест T-Detect COVID является новой технологией, которая оценивает иммунный ответ Т-клеток на COVID-19. Когда компания Adaptive Biotechnologies и технологический гигант Microsoft впервые объединились в 2018 году, они использовали облачные вычисления для «декодирования» иммунной системы. Целью партнерства было использование возможностей биотехнологической компании по определению последовательности иммунитета в сочетании с облачными вычислениями Microsoft для создания универсального анализа крови, который считывает данные об иммунной системе человека для диагностики и лечения заболеваний. В настоящее время в рамках своего исследовательского партнерства Microsoft и Adaptive Biotechnologies уже запустили базу данных ImmuneCODE, которая дает подробное представление об адаптивном иммунном ответе на вирус. База данных находится в свободном доступе для исследователей. Технологии машинного обучения и облачных вычислений Microsoft сыграли ключевую роль в разработке теста на основе Т-клеток.
/14_u3.jpg)
Заключение
Коллективные усилия большой группы исследователей во всем мире значительно расширили научное понимание роли Т-клеток в элиминации вируса SARS-CoV-2. Так, у определенной части людей в силу особенностей иммунитета (возможно, при инфицировании низкой дозой возбудителя) Т-клеточное звено элиминирует вирус из организма без значимой активации В-клеточного звена, то есть с низким уровнем антителообразования, которое иногда не определяется лабораторными методами. При этом у таких людей клинические симптомы не развиваются (инфекционный процесс без развития болезни). Предполагается, что у части людей есть приобретенная невосприимчивость к SARS-CoV-2, обусловленная, вероятнее всего, Т-клетками, которые ранее активировались другими коронавирусами и сохранили иммунологическую память. Недавно ученые проверили старые образцы крови, взятые у людей в 2015–2018 гг. Оказалось, что иммунная система некоторых из них научилась распознавать COVID-19 задолго до начала пандемии, что свидетельствует о том, что их организм уже сталкивался в прошлом с вирусами, имевшими похожие поверхностные белки. До конца данный феномен пока не изучен, но наиболее вероятной является теория о том, что Т-лимфоциты у данных пациентов перекрестно активированы предыдущим воздействием широко циркулирующих в популяции «простудных» коронавирусов. Если человек ранее сталкивался с какими-то коронавирусами, то эти клетки сохранили информацию обо всем семействе коронавирусов, так как у них на 70 % совпадает генетический состав. Эти клетки памяти помогают определенной части населения сохранить иммунитет.
Функцией Т-клеток является уничтожение вируса и формирование клеточной памяти. Память Т-клеток во время повторного воздействия может остановить развитие тяжелого заболевания. По данным исследований, у 93 % людей, которые встречались с вирусом SARS-CoV-2, формировался устойчивый Т-клеточный ответ, несмотря на то что антитела были обнаружены только у 60 % из них. Исследование только гуморального звена иммунитета (определение в крови антител) не может дать полноценной картины иммунного статуса человека. С целью комплексной оценки иммунного ответа совместно с тестами на оценку уровня антител следует определять Т-клетки, специфично отвечающие на антигены вируса SARS-CoV-2.
Что касается возрастных различий, было высказано предположение, что дети могут получать защиту от разнообразного репертуара Т-лимфоцитов, причем взрослые в более старшем возрасте подвержены риску из-за иммунного старения. Снижение числа Т-клеток с возрастом также объясняет, почему пожилые люди гораздо тяжелее переносят COVID-19 (после 30 лет тимус уменьшает производство Т-клеток в организме человека). Было показано, что истощение и сниженное функциональное разнообразие Т-клеток в периферической крови могут предсказывать серьезное ухудшение состояния пациентов с COVID-19 [18]. В подобных публикациях [19, 20] подчеркивается, что необходим дальнейший анализ защитного иммунитета к данной инфекции для понимания патогенеза COVID-19, особенно в тяжелых случаях. Это также имеет значение при разработке эффективной вакцины для защиты от инфекции COVID-19 и ее лечения.
В проведении исследования Т-клеточного иммунитета нуждаются:
- люди с признаками коронавирусной инфекции и симптомами (без антител);
- контактировавшие с больными COVID-19 (на работе или дома);
- перенесшие COVID-19, в крови которых антитела (IgG) не определяются;
- с антителами (для комплексной оценки иммунитета к COVID-19);
- без антител (без признаков коронавирусной инфекции для оценки защищенности от COVID-19);
- после проведения вакцинации.
Изучение Т-клеточного ответа на инфекции — достаточно трудоемкий процесс и чаще выполняется в специализированных научно-исследовательских лабораториях. Тем не менее за короткий промежуток времени (всего один год с начала пандемии) разработаны и внедрены в практику для определения Т-клеточного иммунитета такие лабораторные платформы, как T-SPOT Discovery SARS-CoV-2 и T-Detect COVID. К сожалению, существенным фактором, ограничивающим их широкое использование в клинических лабораториях, является высокая стоимость одного исследования, которая составляет ~ 200 $.
Список литературы
Список литературы находится в редакции