Международный эндокринологический журнал 2(14) 2008

Введение

Эффективность, безопасность применения и индивидуальная переносимость лекарственных средств во многом определяются генетическими факторами, детерминирующими процессы их метаболизма (В.Г. Кукес, 2004). В связи с этим особое значение приобретают фармакогенетические исследования для выявления особенностей действия лекарственных веществ при различных патологических состояниях, а также оценки при этом целенаправленной индукции или репрессии ферментных систем под влиянием различных лекарственных средств (B.K. Park, 2001). Исследования генетического полиморфизма метаболических систем важны для фармакологической коррекции биохимических фенотипов при патологии, а также осуществления диагностики и профилактики заболеваний, оценки индивидуальной чувствительности больных при фармакотерапии. Перспективна для клинической практики разработка методов фармакогенетических исследований, основанных на использовании фармакокинетических подходов анализа метаболизма тест-препаратов и косвенной оценки активности ферментативных систем биотрансформации.

В настоящее время в мире наблюдается пандемия сахарного диабета (СД), который занимает 3-е место среди непосредственных причин смерти после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. СД 2-го типа широко распространен. Так, в структуре диабетической патологии с поздними сосудистыми осложнениями на его долю приходится до 90 % всех случаев [1, 2]. Вопросы патогенеза СД 2-го типа до сих пор до конца не раскрыты. Известно, что СД 2-го типа является гетерогенным и полигенным заболеванием, в патогенезе которого комплексно участвуют как несколько генетических факторов, играющих более значимую роль, чем при СД 1-го типа, так и компоненты внешней среды [3]. Установлено, что при СД имеет место усиление процессов свободнорадикального окисления как в клинике, так и в эксперименте.

Генетическая детерминированность многих патобиохимических процессов обмена веществ, наличие свободнорадикального механизма окислительных процессов при СД определяют большое медицинское и социальное значение разработки методов их фармакогенетического анализа и фармакологической оптимизации терапии этого заболевания. В этой связи представлялось важным проведение оценки систем ацетилирования, микросомального окисления (МО), антиоксидантной защиты при СД 2-го типа, выявление клинических факторов, влияющих на особенности течения заболевания, а также установление возможности воздействия на эти метаболические системы лекарственным препаратом ксимедон, являющимся пиримидиновым производным.

Цель исследования: оценить состояние метаболических систем ацетилирования, микросомального окисления, антиоксидантной защиты у больных сахарным диабетом 2-го типа, установить их взаимосвязь и возможности фармакологического воздействия на эти системы.

Материалы и методы исследования

В основу работы положены результаты обследования 127 больных с СД 2-го типа (возрастной интервал составил от 45 до 78 лет, длительность заболевания — от 1 года до 26 лет), из них 61 пациент без сопутствующих кожно-гнойных инфекций, изучение фенотипов ацетилирования (ФА) проводилось у 61 человека, фенотипов окисления (ФО) — у 45 человек, активности сывороточной холинэстеразы (ХЭ) — у 61 человека, антиоксидантной емкости крови (АОЕ) — у 23 человек, у 66 пациентов был СД 2-го типа, осложненный кожно-гнойными инфекциями. В контрольную группу вошли 103 здоровых добровольца (возрастной интервал составил от 42 до 72 лет), из них: группа изучения ФА — 103 человека; ФО — 39 человек, активности сывороточной ХЭ — 103 человека, АОЕ — 19 человек.

Общеклиническое обследование включало: сбор анамнестических данных, физикальное обследование, общий анализ мочи, определение суточной протеинурии, определение гликозилированного гемоглобина, офтальмологическое и неврологическое обследование.

Экскреция альбумина с мочой определялась на анализаторе DCA 2000 (Bayer, Германия). Микроальбуминурия диагностировалась при суточной экскреции альбумина с мочой от 30 до 300 мг. Офтальмологический осмотр проводили при помощи прямого офтальмоскопа HEINE (Германия), щелевой лампы SL-950 (Италия), фундус-камеры KOVA RX-35 (Япония).

Оценка стабильности почечных цитомембран проводилась косвенным методом по экскреции этаноламина в суточной моче, а также по содержанию этаноламина в крови по методу в модификации Г.В. Барсегяна.

Фенотип ацетилирования и фенотип окисления определялись неинвазивными методами, модифицированными нами путем определения фракции дозы изониазида в моче и оценки уровня содержания антипирина в слюне спектрофотометрическим методом (спектрофотометр СФ-26).

Определение активности ХЭ в сыворотке крови проводилось по методу Эллмана. Определение АОЕ крови — методом гальваностатической кулонометрии (Г.К. Зиятдинова, 2005).

При статистическом анализе использовали параметрические и непараметрические методы. Обработка результатов проводилась с помощью пакета статистических программ Statistica 6.0.

Результаты исследования и их обсуждение

Оценка ферментативной активности метаболических систем

Определение фармакокинетических параметров экскреции тест-препаратов может лежать в основе фенотипирования больных на быстрых и медленных метаболизаторов. Для оценки активности N-ацетилтрансферазы (NAТ) был модифицирован метод определения ФА: как тест-препарат ацетилирования использовался изониазид (однократный прием per os в дозе 0,45 г), мочу собирали каждые 2 ч в течение 6 ч после приема тест-препарата, в почасовых пробах мочи определяли содержание изониазида спектрофотометрическим методом по разработанной нами методике с реагентом метаванадатом аммония. По полученным данным рассчитывали фармакокинетические параметры (табл. 1), строили фармакокинетические кривые и оценивали ФА пациента. Установлен оптимальный фармакокинетический параметр для оценки ФА — фракция дозы экскретируемого изониазида.

По нашим данным, при определении ацетиляторных фенотипов среди здоровых добровольцев 55 % из них относились к медленному и 45 % — к быстрому фенотипу. Кумулятивное количество изониазида, экскретируемого при этом с мочой, представлено в табл. 2.

Для изучения ФО при помощи модифицированного нами метода А.Х. Аширметова как тест-препарат окисления использовался антипирин (однократный прием натощак в дозе 0,6 г), время сбора слюны через каждые 3 ч было сокращено нами с 24 до 12 ч, а параметр времени полувыведения антипирина был заменен на средний уровень его содержания в слюне. Данные о содержании антипирина в трехчасовых пробах в слюне пациентов представлены в табл. 3.

В результате распределения добровольцев контрольной группы по активности цитохромов Р450 при определении ФО выделены 3 группы пациентов: быстрого (20 %), среднего (44 %) и медленного типа (36 %) ацетилирования. Для фенотипирования нами предложена фармакокинетическая модель распределения антипирина после перорального введения, которая представлена на рис. 1.

Полученные результаты демонстрируют высокую эффективность предложенных модифицированных неинвазивных методов фармакогенетического анализа для оценки индивидуальных особенностей метаболических ферментных систем ацетилирования и окисления у больных СД 2-го типа.

Фенотип ацетилирования и активность сывороточной холинэстеразы у больных СД 2-го типа

ФА определен у 61 больного СД 2-го типа (17 мужчин и 44 женщины в возрасте от 45 до 78 лет). По имеющимся литературным данным, соотношение ФА в разных этнических группах отличается, поэтому при формировании группы придавалось значение ее однородности: в группу входили представители европейской популяции, проживающие в Республике Татарстан.

Нами установлено, что ацетиляторные фенотипы у больных СД 2-го типа отличаются от таковых среди здоровых и характеризуются преобладанием пациентов быстрого ацетиляторного фенотипа (62 %). Можно предположить, что это обусловлено как снижением синтеза жирных кислот из ацетилкоэнзима А (что является следствием дефицита инсулина), так и влиянием повышенного липолиза на ускорение ацетилирования за счет повышения уровня ацетилкоэнзима А как донора ацетоацила.

Для выявления возможного влияния генетически детерминированной скорости ацетилирования на прогноз СД 2-го типа проведен анализ распределения ФА в зависимости от длительности СД, пола и возраста пациентов, состояния углеводного обмена, диабетической ретинопатии, нейропатии и нефропатии.

Среди больных с длительностью СД 2-го типа менее 10 лет у 53,19 % пациентов выявлен быстрый ФА, а у 46,81 % — медленный. Однако в группе больных с длительностью СД более 10 лет быстрый ФА выявлен у 71,88 % пациентов, медленный — у 28,12 % (рис. 2). Распределение ФА у больных в зависимости от состояния компенсации углеводного обмена СД представлено на рис. 3.

Для анализа ФА в зависимости от наличия диабетической нефропатии были выделены 2 группы больных. В группе пациентов с нормоальбуминурией СД 2-го типа быстрый ФА выявлен у 54,16 % человек, медленный — у 45,84 %. Из группы СД 2-го типа с микроальбуминурией и макроальбуминурией быстрый ФА выявлен у 73,91 % больных, медленный — у 26,09 % (p < 0,05).

При анализе скорости ацетилирования в группах больных СД 2-го типа пол, возраст, наличие диабетической ретинопатии, нейропатии не оказывали статистически значимого влияния на различия между быстрым и медленным ФА (p > 0,05).

Выявлено, что с увеличением длительности СД 2-го типа, при декомпенсации углеводного обмена и прогрессировании диабетической нефропатии отмечается тенденция к увеличению количества больных с быстрым ФА, что отражает метаболические нарушения. Результаты исследований свидетельствуют, что у пациентов с быстрым ФА вероятность осложненного течения СД 2-го типа значительно выше, чем у пациентов с медленным ФА.

У больных с быстрым и медленным ФА в ряде показателей, характеризующих функцию почек, выявлены некоторые статистически значимые корреляции. Так, обнаружена взаимосвязь между быстрым ФА и уровнем этаноламина мочи (r = +0,42, p < 0,05, n = 30); уровнем этаноламина крови (r = +0,32, p < 0,05, n = 30); а также взамиосвязь быстрого ФА с уровнем щавелевой кислоты мочи (r = +0,4, p < 0,05, n = 30). Это позволяет предположить возможную нестабильность почечных цитомембран у больных СД

2-го типа с быстрым ФА. По-видимому, высвобождение из цитомембран эпителия нефрона повышенного количества фосфатидилэтаноламина может приводить к усилению биосинтеза щавелевой кислоты. При этом основным эндогенным фактором, влияющим на уровень экскреции оксалата, является нарушение функции проксимального канальца, что выражается в изменении экскреции этаноламина.

Другим не менее важным генетически детерминированным ферментом является ХЭ, уровень активности которой характеризует синтетическую активность печени. Полученные данные свидетельствуют о статистически значимом увеличении уровня ХЭ по сравнению с группой здоровых добровольцев (p < 0,001). Механизм повреждения печени при СД 2-го типа связан со снижением запасов гликогена в гепатоцитах, переполнением печеночных клеток липидами, способствующими развитию стеатоза печени. В группах здоровых добровольцев и больных СД 2-го типа были проведены одновременная оценка активности сывороточной ХЭ и фенотипирование активности NАТ. При этом распределении высокие значения активности ХЭ позволили достоверно выделить группу больных с очень низкими значениями скорости ацетилирования. Следует отметить, что активность ХЭ у пациентов с быстрым и медленным ФА статистически значимо не отличалась (рис. 4, табл. 4).

Состояние системы микросомального окисления у больных СД 2-го типа

Функциональное состояние системы МО было изучено у 45 человек. По активности цитохромов P450 в изучаемой группе больных выделялись 2 статистически значимо различающиеся подгруппы: 22 % пациентов относились к среднему и 78 % — к медленному ФО, в то время как среди здоровых добровольцев было представлено трехмодальное распределение. Фармакокинетические параметры антипирина приведены в табл. 5.

Для выявления возможного влияния активности МО на прогноз СД 2-го типа проведен анализ распределения ФО в зависимости от длительности СД 2-го типа, пола, возраста пациентов, компенсации углеводного обмена, наличия диабетической ретинопатии, нейропатии и нефропатии. Проведенные нами исследования не выявили зависимости активности этой системы от диабетической ретинопатии и полинейропатии. Наши исследования показали, что функциональное состояние системы МО связано с длительностью СД (табл. 6). В то же время наблюдаются статистически значимые различия системы МО в зависимости от пола и возраста (p < 0,05) (рис. 5, 6).

Анализ активности системы МО у больных в зависимости от компенсации углеводного обмена представлен на рис. 7. Как видно, у больных с декомпенсацией СД 2-го типа по сравнению с группой компенсированных и субкомпенсированных пациентов наблюдается перераспределение соотношения средних и медленных ФО. Распределение активности МО у больных в зависимости от диабетической нефропатии представлено на рис. 8. При этом наблюдаются различные соотношения ФО в группе больных с нормоальбуминурией, микроальбуминурией и макроальбуминурией.

Мы сопоставили активность NAT среди здоровых добровольцев с медленным, средним и быстрым ФО. Было установлено, что медленному типу окисления соответствует быстрый тип ацетилирования, быстрому типу окисления — медленный тип ацетилирования, среднему же типу окисления свойственны как высокая активность NАТ, так и низкая. Проведенный анализ по сравнению данных активности NAT у больных СД 2-го типа с медленным и средним ФО не показал статистически значимых различий между ними (p > 0,05).

Таким образом, выявлено, что у больных СД 2-го типа совсем не представлен быстрый ФО, что, возможно, обусловлено уменьшением количества соответствующих субстратов и нарушением баланса между способностью медленных окислителей быстро ацетилировать вещества, а быстрых окислителей медленно их окислять. С увеличением длительности заболевания, при наличии декомпенсации и прогрессировании тяжести диабетической нефропатии наблюдается замедление элиминации тест-препарата под влиянием микросомальных ферментов.

Оценка интегральной антиоксидантной емкости крови у больных СД 2-го типа

Известно, что у пациентов с СД наблюдается дефицит эндогенных факторов, способных проявлять антиоксидантные свойства. В связи с этим у больных СД 2-го типа проведено исследование состояния АОЕ как показателя, отражающего суммарное содержание антиоксидантов. Для изучения АОЕ крови были обследованы 23 пациента с СД 2-го типа в возрасте от 54 до 68 лет, продолжительность заболевания составила от 3 до 26 лет. Нами установлено статистически значимое понижение АОЕ крови у больных СД 2-го типа по сравнению с группой здоровых добровольцев. Проведенные исследования подтверждают необходимость проведения терапии, направленной на торможение процессов перекисного окисления липидов. В качестве такого лекарственного средства использовался ксимедон.

В зависимости от принадлежности к быстрому или медленному ФА больным СД 2-го типа ксимедон назначался в различных терапевтических дозах. Продолжительность терапии ксимедоном при этом в обоих случаях составила 3 недели. В результате исследования наблюдается статистически значимое увеличение АОЕ после коррекции ксимедоном в дозе 0,5 г 3 раза в сутки ежедневно как у больных с быстрым, так и медленным ФА по сравнению с показателем АОЕ до терапии ксимедоном и статистически незначимое увеличение АОЕ у больных, получающих терапию ксимедоном в дозе 0,25 г 2 раза в день (табл. 7, 8). Эти результаты позволяют рекомендовать ксимедон для коррекции состояния антиоксидантной системы при СД 2-го типа.

Фармакологическая регуляция активности ацетилирования ксимедоном

Важной проблемой является осуществление целенаправленного воздействия на метаболические ферментные системы для достижения нужного фармакологического эффекта. Под действием некоторых лекарственных препаратов может происходить ускорение или замедление метаболизма изониазида в результате индукции или ингибирования фермента NАТ. Нами установлено, что ксимедон обладает свойством индуцировать активность процессов ацетилирования. При больших дозах ксимедона более значительная индукция характерна для пациентов с быстрым ФА; при меньших дозах — для пациентов с медленным ФА. По полученным результатам рассчитаны фармакокинетические параметры изониазида при индукции ацетилирования, изучены дозозависимые эффекты, найден максимальный интервал сохранения индукции ксимедоном.

Этот эффект использован у больных СД 2-го типа с сопутствующими кожно-гнойными инфекциями. Для изучения были отобраны больные СД 2-го типа с сопутствующей кожно-гнойной инфекцией: 43 человека с медленным ФА и 23 человека с быстрым ФА. Контрольную группу составили практически здоровые добровольцы в количестве 35 человек. В комплексную терапию пациентов был включен ксимедон по 125 мг 2 раза в день в дозе, которая, по полученным ранее клинико-экспериментальным данным, вызывает максимальный эффект индукции ацетилирования у человека.

После первичного приема ксимедона исследовалась индукция, которая проявилась у пациентов с медленным ФА и фактически отсутствовала у больных с быстрым ФА. Отсутствие индукции сохранялось у всех пациентов с быстрым ФА к концу лечения. У больных же с медленным ФА эффект индукции к концу лечения сохранялся, что привело к типизации многих медленных ацетиляторов в быстрые. Рассчитаны фармакокинетические параметры экскреции изониазида с мочой для пациентов с медленным и быстрым ФА до приема ксимедона, при однодневном и курсовом приеме препарата.

Индукция ацетилирования ксимедоном у больных СД 2-го типа способствует более качественному и быстрому прекращению патологического гнойно-септического процесса на коже, что позволяет использовать его в комплексной терапии кожных гнойно-септических инфекций при сахарном диабете.

Выводы

1. У больных сахарным диабетом 2-го типа преобладает быстрый фенотип ацетилирования (62 %) в сравнении со здоровыми добровольцами (45 %). Скорость ацетилирования имеет тенденцию к увеличению с возрастанием длительности сахарного диабета 2-го типа, при декомпенсации углеводного обмена и прогрессировании диабетической нефропатии. Быстрый фенотип ацетилирования имеет положительную корреляционную связь с содержанием этаноламина в моче и крови, а также щавелевой кислоты в моче у больных сахарным диабетом 2-го типа.

2. Больные сахарным диабетом 2-го типа по активности цитохромов P450 распределяются на 2 фенотипические группы: средний (22 %) и медленный фенотип окисления (78 %) в сравнении со здоровыми, которым свойственно тримодальное распределение: быстрый ФО (21 %), средний (43 %) и медленный (36 %). У больных сахарным диабетом 2-го типа с увеличением длительности заболевания, при наличии декомпенсации и стадий микро- и макроальбуминурии замедляется элиминация тест-препарата окисления антипирина.

3. У больных сахарным диабетом 2-го типа снижение активности процессов перекисного окисления липидов характеризуется уменьшением интегральной антиоксидантной емкости крови. Ксимедон в суточной дозе 1,5 г per os в течение 3 недель проявляет свойство повышать интегральную антиоксидантную емкость крови у больных сахарным диабетом 2-го типа с быстрым и медленным ФА.

4. Ксимедон проявляет максимальный эффект индукции на активность N-ацетилтрансферазы у здоровых добровольцев в дозе 125 мг 2 раза в день. Эта же доза вызывает эффект ускорения выздоровления при наличии сопутствующих кожно-гнойных инфекций у больных сахарным диабетом 2-го типа.