Журнал «Медицина неотложных состояний» Том 18, №6, 2022
Вернуться к номеру
Молекулярно-генетичні й фенотипові особливості штамів F.tularensis holarctica в Україні
Авторы: Нехороших З.М., Процишина Н.М., Самойленко В.О., Маньковська Н.М., Загоруйко М.О., Бондаренко Д.А.
Філія «Протичумний інститут імені І.І. Мечнікова» ДУ «Центр громадського здоров’я МОЗ України», м. Одеса, Україна
Рубрики: Медицина неотложных состояний
Разделы: Медицинские форумы
Версия для печати
Вступ. На всій території України в різних ландшафтно-географічних зонах (Полісся, лісостеп, степ) зареєстровані численні тривало функціонуючі природні осередки туляремії, епізоотична активність яких підтверджується майже щорічною ізоляцією штамів підвиду F.tularensis holarctica.
Останнім часом все більш широкого застосування набувають молекулярно-біологічні методи дослідження, які дозволяють слідкувати за структурою популяції F.tularensis з метою виявлення джерела інфекції, оцінки, прогнозування епідситуації та своєчасної її корекції на основі молекулярно-епідеміологічного моніторингу.
Мета роботи — визначити генотипічні й фенотипові особливості штамів F.tularensis holarctica в популяції збудника, що циркулює в природних осередках туляремії на території України.
Матеріали та методи. Генотипову характеристику 222 природних ізолятів F.tularensis, які виділені з різних джерел (дикі ссавці — 50, кліщі — 125, вода — 43, люди — 4) за період з 1967 по 2018 рік, визначали з застосовуванням мультилокусного VNTR-аналізу (Multilocus VNTR Analysis, MLVA). Диференціювання штамів F.tularensis проводили на основі алельних варіантів 5 поліморфних VNTR-локусів (FT-M3, FT-M6, FT-M19 і FT-M20, FT-M24). Усі природні ізоляти за морфологічними й біохімічними властивостями ідентифіковані як представники виду F.tularensis і підвиду F.tularensis holarctica, що підтверджено також при використанні авторської ПЛР тест-системи (патент UA 75546).
Вірулентні властивості штамів F.tularensis досліджували з використанням двох експериментальних моделей: in vitro — при взаємодії збудника туляремії з клітинами периферичної крові людини (ПКЛ) (патент UA 37715) та in vivo — з клітинами паренхіматозних органів білих мишей. Контрольним зразком слугував вакцинний штам F.tularensis 15 Гайського.
Результати. На основі проведеного ретроспективного вивчення генотипової структури значної колекції збудника туляремії встановлені відмінності індивідуальних штамів F.tularensis за кратністю алельних повторів і поєднанням їх комбінацій у поліморфних VNTR-локусах FT-M3, FT-M6, FT-M20. Зареєстровано 19 алелей у локусі FТ-M3 (9–29), 6 алелей у FТ-M6 (4–9) і 2 алелі в FТ-M20 (3–4). Найбільша кількість повторів в локусі FТ-M3 (29) встановлена у штамів зони Полісся (Чернігівська область), але близькоспоріднені варіанти виявлені у штамів зон лісостепу й степу. У локусі FТ-M6 переважно встановлені алелі з 4 повторами (163 штами), 5 повторів виявлено тільки в штамів зони степу (Одеська область), 9 повторів зареєстровано в окремих штамів всіх трьох зон.
Особливо важливим є факт визначення у більшості штамів (203) 3 повторів у локусі FТ-M20, що характерно для вірулентних патогенів, і лише в 19 виявлено 4 повтори, як у вакцинних штамів (F.tularensis 15 Гайського і LVS) з ослабленою вірулентністю. Отримані дані свідчать про циркуляцію в природі F.tularensis з різною вірулентністю. Вважаємо, що отримані алельні варіації тандемних повторів VNTR-локусів можуть бути молекулярною основою при формуванні генотипної неоднорідності збудника туляремії.
При використанні MLVA встановлена різноманітність генотипової структури дослідженої популяції збудника туляремії. Ідентифіковано 48 генотипів (спільних, довгоперсистуючих, унікальних), які умовно розподілені на 3 групи (А, В, С). До найбільшої групи А ввійшов 31 генотип (178 штамів), до групи В — 9 генотипів (25 штамів), до групи С — 8 генотипів (19 штамів).
Ретроспективно встановлені відмінності за терміном циркуляції штамів F.tularensis різних груп генотипів на території всіх трьох зон України. Циркуляція штамів генотипів групи А виявлена із 70-х років минулого століття, а генотипів груп В і С — тільки з 2000 року. Важливо підкреслити, що особливою рисою генотипів групи В (25 штамів) була наявність в VNTR-локусі FT-M6 максимальної кількості повторів (9), тоді як у більшості штамів групи А (148) у зазначеному локусі визначено 4 повтори.
Виявлені особливості територіального поширення окремих генотипів. Штам F.tularensis генотипу А5/7, що ізольований у 1967 році від водяного щура, циркулював тільки в Полтавській області. Штами, що віднесені до генотипів А13 (ссавці, кліщі, 1993–1995), А15 (кліщі, 1995, 1999) та А22/5 (миша хатня, 1998), виявлені лише в Одеській області на фоні епізоотій і епідемії туляремії (1997–1998). Циркуляція штамів генотипів А31, А171 (кліщі, 2011) встановлена в Чернігівській області.
Встановлено також певну хазяїнову приналежність ідентифікованих генотипів F.tularensis. Так, 2 штами F.tularensis генотипу А1 ізольовані в 2005 році лише від диких ссавців під час зареєстрованої епізоотії (Львівська область) і 1 штам генотипу А1 виділено з води на фоні епідускладнень (Сумська область). Слід зазначити, що у 2005 році в Сумській області було ізольовано також 3 штами генотипу А23 від людей під час підйому захворюваності на туляремію. Особливим є факт ізоляції в Сумській області штамів групи генотипів А як з мінімальною кількістю повторів в VNTR-локусі FT-M3 (9) — штам № 48 генотипу А1 (вода, 2005), так і з максимальною кількістю (28) — штами № 348, 351, 359 генотипу А23 (люди, 2005).
Більша генотипна різноманітність штамів F.tularensis зареєстрована в зоні Полісся, де виявлено 20 унікальних генотипів, а в зонах лісостепу і степу — лише 10. Різноманітність генотипів штамів F.tularensis, можливо, пояснюється варіаціями довжин поліморфних VNTR-локусів, а також різною еколого-географічною характеристикою досліджених територій, видами носіїв і переносників збудника туляремії.
Вірулентні властивості 48 штамів F.tularensis різних груп генотипів (група А — 27 штамів, В — 5, С — 5) вивчали in vitro в системі клітин ПКЛ (макрофаги, нейтрофіли, еозинофіли та інші). Встановлено, що для штамів F.tularensis генотипів групи А клітинами-мішенями були макрофаги, у яких виявляли найбільш ранні й тяжкі ушкодження ядерного апарату. Штами генотипів груп В і С обумовлювали значні деструктивні зміни в структурі нейтрофілів, які призводили до їх раннього апоптозу, а також десекреції гранул еозинофілів, що свідчило про те, що саме нейтрофіли й еозинофіли є клітинами-мішенями для F.tularensis зазначених груп генотипів. Вважаємо, що рання цитодеструкція макрофагів і апоптоз нейтрофілів можуть слугувати основними критеріями оцінки вірулентності штамів F.tularensis.
При паралельному вивченні вірулентних властивостей штамів F.tularensis in vivo виявлено, що склад клітин паренхіматозних органів білих мишей зазнавав значних ушкоджень. Виражені деструктивні зміни ядерного апарату макрофагів приводили до їх повного руйнування, що сприяло поширенню патогену й утворенню нових осередків інфекції.
Встановлена кореляція результатів порівняльного вивчення вірулентності штамів F.tularensis з використанням двох експериментальних моделей in vitro та in vivo. Найбільш ранні й тяжкі цитодеструктивні ушкодження клітин ПКЛ і паренхіматозних органів білих мишей зумовлювали штами F.tularensis генотипів групи А, що ізольовані з різних джерел, у тому числі від людей на фоні епідускладнень, що свідчило про їх високу вірулентність.
Отже, на основі експериментального ретроспективного вивчення біологічних властивостей значної колекції штамів F.tularensis holarctica встановлені їх генотипові й фенотипові особливості, а також значення в епідпроцесі туляремійної інфекції.
Висновки. Встановлена гетерогенність генотипової структури дослідженої популяції штамів збудника туляремії та різний ступінь їх патогенності всередині підвиду F.tularensis holarctica. Визначено, що домінуючими й найбільш епідемічно значимими високовірулентними геноваріантами виявились штами F.tularensis генотипів групи А.