Журнал «Здоровье ребенка» 3(12) 2008

Генерация нейтрофилами крови активных форм кислорода (АФК) в ходе респираторного взрыва является одним из звеньев фагоцитоза, необходимого для обеспечения неспецифического иммунитета [13, 18]. В связи с функциональной незрелостью лейкоцитов новорожденные обладают повышенной предрасположенностью к бактериальным инфекциям, при этом неспецифический иммунитет особенно важен в неонатальном периоде [11, 20, 21]. В то же время функции и роль нейтрофилов в иммунных реакциях остаются малоизученными, и есть мнение, что диагностика фагоцитарной системы не разработана [9, 12, 22].

Одним из инструментов изучения респираторного взрыва нейтрофилов in vitro является реакция восстановления ими нитросинего тетразолия (НСТ-тест). НСТ-тест может проводиться как при стимуляции нейтрофилов (индуцированный НСТ-тест), так и без нее (спонтанный НСТ-тест). В ходе реакции НСТ восстанавливается до нерастворимого диформазана, откладывающегося в клетках в виде темно-синих гранул, которые визуально определяются путем микроскопирования [1].

Результаты НСТ-теста у новорожденных в отличие от таковых у взрослых противоречивы [10, 13, 14, 16, 19, 22]. При этом отмечают, что использование НСТ-теста в качестве диагностического у новорожденных приводит как к ложноположительным, так и к ложноотрицательным результатам, и это, возможно, является одной из причин ограниченного его применения для диагностики заболеваний в неонатальном периоде [6]. Указанные несоответствия могут быть обусловлены различиями условий проведения НСТ-теста, от которых зависят получаемые результаты [3–5]. В то же время отмечают значение исследования кинетики клеточных процессов для углубления понимания их сути, что показано, в частности, применительно к реакции восстановления НСТ нейтрофилами [3, 5, 15, 17]. В частности установлено, что в фагоцитозе нейтрофилы функционально неоднородны и представлены двумя субпопуляциями: нейтрофилы-киллеры (Н_к) и нейтрофилы-кейджеры (Н_с) [2, 3]. При этом Н_k — потенциальные классические фагоциты, выработка АФК которыми направлена на уничтожение чужеродного агента, а Н_c поглощают инородные частицы, после чего доставляют их в компетентные органы и вырабатывают АФК с целью самозащиты. При этом Н_c характеризуются разной степенью активности и практически все активируются в результате стимуляции.

Поскольку некротизирующий энтероколит новорожденных (НЭК) — острый некротизирующий кишечный синдром, вызываемый инфекционными агентами на фоне незрелости механизмов местной защиты и/или гипоксически-ишемического повреждения слизистой кишечника, склонный к генерализации с развитием системной воспалительной реакции, нам было интересно оценить диагностическую значимость НСТ-теста при этом заболевании [7, 11].

С целью оценки диагностической значимости НСТ-теста при НЭК исследовали кинетику восстановления НСТ нейтрофилами недоношенных новорожденных.

Материалы и методы

Обследовали 98 недоношенных новорожденных обоих полов в возрасте 1–28 суток. Контрольную группу (условно здоровые) составили 27 недоношенных новорожденных. В анамнезе беременности и родов матерей этих детей отсутствовали факторы риска внутриутробного и интранатального бактериального инфицирования плода. В группу наблюдения вошел 71 недоношенный ребенок с клинически и лабораторно подтвержденным НЭК [7, 11]: у 34 детей диагностирована II стадия НЭК, у 37 — I стадия заболевания. Учитывая диагностическую направленность работы, детей с III стадией НЭК в исследование не включали.

Кровь (1 мл) брали по показаниям, гепаринизировали (5 ЕД/мл) и проводили спонтанный НСТ-тест по методике М.Е. Виксмана, А.Н. Маянского [1] в модификации И.Г. Герасимова, Д.Ю. Игнатова [5]: к 0,1 мл крови добавляли 0,05 мл 0,2% раствора НСТ в калий-фосфатном буфере (0,1, рН 7,3) и 0,05 мл того же буфера. Реакционную смесь термостатировали на водяной бане при 37 °С (30–60 мин), делали мазки средней плотности, высушивали на воздухе, фиксировали в этиловом спирте (20 мин), окрашивали водным раствором нейтрального красного (0,1%, 20 мин) и микроскопировали под иммерсией. Среди 100 клеток подсчитывали долю активированных нейтрофилов (ДАН, %), содержащих гранулы диформазана. По количеству отложившегося в клетках диформазана оценивали их активность в условных единицах и рассчитывали индекс активации нейтрофилов (ИАН) [1]:

ИАН = (0 х Н₀ + 1 х Н₁ + 2 х Н₂ + 3 х Н₃) / 100,

где Н₀, Н₁, Н₂, Н₃ (%) — количество нейтрофилов с активностью 0, 1, 2 и 3 балла соответственно.

При этом субпопуляцию нейтрофилов Н_к составляют клетки Н₀ (неактивированные Н_к) и Н₃ (активированные Н_к, Н_k^а), а Н_с — Н₁ и Н₂. Погрешность измерения ДАН не превышала ± 4,7 %.

Среднее (М) и его доверительный интервал (m_t) рассчитывали с доверительной вероятностью P = 0,95 (p = 0,05), корреляционный и регрессионный анализы проводили, используя пакет статистических программ STATISTICA, v. 6.

Результаты и их обсуждение

В табл. 1 приведены значения ДАН, полученные на 60-й мин реакции восстановления НСТ (ДАН₆₀), и рассчитанные значения ДАН_∞ в контрольной группе и при наличии НЭК. Как видно из табл. 1, значения ДАН₆₀ у недоношенных новорожденных как при заболевании, так и в его отсутствие ниже, чем ДАН_∞. При наличии НЭК различия между показателями оказываются достоверными (p < 0,05). Приведенные факты указывают на незавершенность восстановления НСТ на 60-й мин реакции, причем степень незавершенности может быть разной в зависимости от наличия/отсутствия заболевания или на разных его стадиях. Сказанное делает необходимым расчет ДАН_∞ по кинетическому уравнению [1] для корректного сопоставления результатов НСТ-теста.

Однако прежде чем анализировать результаты НСТ-теста, рассмотрели зависимость массы тела при рождении (МР) от степени недоношенности (НДН) на разных стадиях НЭК (табл. 2). Анализ данных таблицы показал, что масса тела недоношенных новорожденных уменьшается (p < 0,05) с увеличением степени недоношенности, что согласуется с известными литературными данными [7, 11]. При этом средние значения массы тела составляют 2100, 1600 и 1300 г при недоношенности 1, 2, 3-й степени соответственно. При наличии НЭК масса тела новорожденного ниже (p < 0,05), чем в контрольной группе, независимо от степени недоношенности. Уменьшение показателя в большей мере проявляется при заболевании в стадии II по сравнению с НЭК в стадии I для всех обследованных независимо от степени недоношенности (различия недостоверны, p > 0,5). Данные табл. 2 позволили установить, что недоношенность 2-й или 3-й степени является неблагоприятным прогностическим признаком развития НЭК. Более того, если НЭК в стадии I диагностирован только у недоношенных 2-й степени, то НЭК в стадии II — у недоношенных 2-й и 3-й степени. Приведенные данные могут оказаться полезными как для ранней диагностики НЭК, так и для дифференциальной диагностики стадии заболевания.

В табл. 3 приведены значения параметров кинетического уравнения [1] в контрольной группе и при наличии НЭК в целом и на разных его стадиях. Как видно из табл. 3, значения ДАН_∞ возрастают (p < 0,05) с увеличением степени недоношенности (обратно пропорционально МР), а также при НЭК независимо от стадии по сравнению с контролем и имеют тенденцию к увеличению при НЭК в стадии II по сравнению с НЭК в стадии I. Тенденции значений k₁ в зависимости от степени недоношенности или стадии заболевания аналогичны таковым для ДАН_∞, однако изменения показателя недостоверны (p > 0,5).

Следовательно, развитие заболевания приводит к увеличению значений ДАН, выявляемых в НСТ-тесте. При этом скорость процесса восстановления НСТ нейтрофилами несколько замедляется. Таким образом, доля активированных нейтрофилов, рассчитанная для бесконечного времени процесса (t > ∞, то есть когда ДАН перестает зависеть от времени), наряду с другими показателями, может служить ранним диагностическим признаком заболевания.

Помимо кинетических параметров диагностически значимыми могут оказаться соотношения клеток среди двух субпопуляций нейтрофилов: нейтрофилов-кэйджеров, доставляющих инородный агент в компетентные органы, и нейтрофилов-киллеров, способных осуществлять фагоцитоз in suti [2, 8, 13].

Значения обоих показателей в контрольной группе и у новорожденных с НЭК приведены в табл. 4. При НЭК значения Н_с больше, а Н_к меньше (p < 0,05) по сравнению с группой контроля независимо от стадии заболевания. В случае Н_с для разных степеней НЭК наблюдается лишь тенденция, что, очевидно, связано с погрешностью измерения показателя. При этом с увеличением степени недоношенности доля Н_с увеличивается, а доля Н_к уменьшается (аналогично МР). По сравнению с недоношенностью 1-й степени доля Н_с выше, а доля Н_к ниже (p < 0,05 при 2-й степени недоношенности, и оба показателя имеют тенденцию к уменьшению при 3-й степени недоношенности. Для доли активных Н_к (Н_к^а) наблюдается тенденция к снижению при недоношенности 3-й степени, а также при НЭК в стадии II по сравнению с НЭК стадии I (табл. 4).

Следовательно, увеличение степени недоношенности, наличие НЭК и развитие заболевания приводят к уменьшению количества нейтрофилов-киллеров (потенциальных фагоцитов) и доли активных клеток среди них. Наоборот, количество нейтрофилов-кейджеров, доставляющих инфекционный агент в компетентные органы, увеличивается. Полученные результаты, несомненно, свидетельствуют об угнетении звена неспецифического иммунитета в периферической крови как при недоношенности любой степени, так и при наличии НЭК, причем ситуация ухудшается с развитием заболевания и/или степени недоношенности.

Что касается скорости процесса активации нейтрофилов, значения k₁ имеют тенденцию к увеличению с ростом степени недоношенности и стадии НЭК. Приведенный факт, очевидно, указывает на включение компенсаторных механизмов, направленных на ликвидацию явлений, связанных с угнетением неспецифического иммунитета в периферической крови при заболевании. Тенденции изменения величины V_max в зависимости от степени недоношенности или стадии НЭК аналогичны таковым для Н_к^а: показатель уменьшается с увеличением степени недоношенности и стадии НЭК (p > 0,5), в последнем случае независимо от степени недоношенности (табл. 4). Последний результат указывает на то, что компенсаторные механизмы, обусловливающие увеличение скорости процесса активации нейтрофилов, оказываются недостаточными для ликвидации последствий нарушения неспецифических функций клеток в периферической крови, причем наличие заболевания усугубляет эти негативные явления.

Следовательно, наряду с другими показателями количественные соотношения среди субпопуляций нейтрофилов могут оказаться значимыми в ранней диагностике НЭК и дифференциальной диагностике заболевания.

Таким образом, развитие НЭК приводит к изменению соотношения в субпопуляциях нейтрофилов, причем доля Н_с увеличивается, тогда как доля Н_к (потенциальных фагоцитов), наоборот, уменьшается (табл. 4), указывая на ослабление неспецифического иммунитета в периферической крови при заболевании. При этом наблюдаемое увеличение ДАН (табл. 3), по всей видимости, является компенсаторной реакцией.