Журнал «Здоровье ребенка» 3(12) 2008

Люмбальная пункция и исследование цереброспинальной жидкости

Люмбальная пункция проводится главным образом с целью получения ЦСЖ для лабораторного исследования, а также с лечебной целью.

Показания

1. Подозрение на инфекционные заболевания ЦНС (менингит или энцефалит).

2. Подозрение на внутричерепное (субарахноидальное или внутримозговое) кровоизлияние (если КТ невозможна или дает отрицательные результаты).

В лечебных целях к люмбальной пункции прибегают для дренирования ЦСЖ и снижения давления (например, при нормотензивной гидроцефалии, доброкачественной внутричерепной гипертензии или субарахноидальном кровоизлиянии), эндолюмбального введения лекарственных средств (например, антибиотиков при менингитах).

Противопоказания

1. Инфекция в месте предполагаемой пункции.

2. Подозрение на объемный процесс (абсцесс, опухоль, субдуральная гематома), особенно в задней черепной ямке, на что указывают нарастающие симптомы внутричерепной гипертензии, прогрессирующие очаговые симптомы, застойные диски зрительных нервов. В этих случаях перед проведением люмбальной пункции нужно обязательно исследовать глазное дно и провести ЭхоЭС.

3. Выраженная тромбоцитопения (менее 40 тыс./мкл) или снижение времени свертывания крови (более чем на 50 %).

Однако в двух ситуациях, несмотря на противопоказания, люмбальную пункцию все же приходится проводить: при наличии отека дисков зрительных нервов — когда есть подозрение на гнойный менингит, при доброкачественной внутричерепной гипертензии. В обоих случаях перед проведением люмбальной пункции нужна консультация невролога или нейрохирурга.

Методика проведения люмбальной пункции. Для успешного проведения люмбальной пункции решающее значение имеет правильное положение больного. Непосредственно перед пункцией ему придают эмбриональную позу, укладывая на бок и максимально наклоняя голову и сгибая ноги в коленных и тазобедренных суставах. На уровне линии, соединяющей верхние задние ости подвздошных костей, между остистыми отростками позвонков пальпаторно определяют промежуток L₃–L₄, в котором обычно производят пункцию. Но поскольку спинной мозг оканчивается на уровне L₁, допустимо проведение прокола выше этого уровня (в промежутке L₂–L₃) или ниже (в промежутке L₄–L₅). Перед пункцией кожу обрабатывают йодом, начиная с места предполагаемой пункции и далее в виде концентрических кругов. Затем йод тщательно удаляют спиртом, чтобы избежать его попадания в субарахноидальное пространство. Место пункции окружают стерильной простыней. Проводят анестезию места предполагаемой пункции 0,5% раствором новокаина. Вначале раствор вводят внутрикожно, добиваясь получения «лимонной корки», а затем еще несколько миллилитров инъецируют в более глубокие слои. В пункционную иглу вставляют мандрен, прокалывают кожу и уточняют направление иглы. Иглу вводят по средней линии строго горизонтально, но ее конец направляют слегка под углом к голове (параллельно остистым отросткам), примерно по направлению к пупку. Срез иглы должен быть параллелен оси позвонка. По мере введения иглы последовательно преодолевается сопротивление желтой связки и твердой мозговой оболочки. После прокола твердой мозговой оболочки иглу вводят очень медленно, время от времени извлекая мандрен, чтобы проверить, не вытекает ли ЦСЖ. При попадании в субарахноидальное пространство возникает ощущение провала. При появлении ЦСЖ иглу продвигают еще на 1–2 мм, а ее срез поворачивают перпендикулярно оси позвоночника. Затем больного просят расслабиться и осторожно выпрямить голову и ноги. После извлечения мандрена, не допуская истечения ЦСЖ, к игле присоединяют манометр и измеряют давление ЦСЖ, которое в норме составляет 100–150 мм вод.ст. При неосторожном введении иглы можно продвинуть ее слишком далеко и проколоть венозное сплетение, что приведет к появлению крови в ЦСЖ («травматическая пункция»).

Истечение ЦСЖ можно усилить с помощью покашливания, надавливания на живот или яремные вены. Эти приемы затрудняют венозный отток от спинного мозга и повышают давление. Если игла не попала в субарахноидальное пространство или уперлась в кость, ее надо потянуть на себя, не извлекая полностью (срез должен остаться под кожей) и, изменив направление, ввести вновь.

ЦСЖ собирают не менее чем в 3 стерильные пробирки: в первую — для измерения концентрации белка и глюкозы, после чего содержимое пробирки центрифугируют, а осадок подвергают бактериоскопическому исследованию; во вторую — для определения клеточного состава и серологического исследования; в третью пробирку — для бактериологического исследования ликвора. При подозрении на туберкулезный менингит берут четвертую пробирку — для выявления фибриновой пленки. При высоком давлении ЦСЖ следует извлекать лишь небольшое ее количество, но в остальных случаях не следует слишком ограничивать объем выводимой жидкости, так как основные потери происходят через дефект мозговых оболочек, проделанный иглой (до 30 мл и более), к тому же скорость продукции ЦСЖ довольно велика (20 мл/ч). Чтобы уменьшить дефект, следует использовать более тонкие иглы, а срез иглы направлять параллельно оси позвоночника, так как при этом игла раздвигает, а не разрывает волокна.

После забора ЦСЖ иглу извлекают. Иногда при вставлении мандрена перед извлечением иглы может произойти ущемление корешка с последующим его отрывом, поэтому иглу рекомендуют извлекать без мандрена.

Если проведение люмбальной пункции невозможно из-за костных аномалий или инфекций в месте пункции, то прибегают к субокципитальной пункции.

Осложнения. Наиболее грозным осложнением люмбальной пункции является вклинение, обычно возникающее у больных с объемным процессом на фоне внутричерепной гипертензии. Внезапное падение давления в позвоночном канале может спровоцировать вклинение миндалин мозжечка в большое затылочное отверстие или крючка гиппокампа в вырезку намета мозжечка. Поэтому, если давление ЦСЖ оказалось высоким, для исследования следует извлечь лишь минимальное количество ЦСЖ и, назначив маннитол и кортикостероиды, установить наблюдение за больным. При ухудшении состояния во время люмбальной пункции или высоком риске вклинения иглу со вставленным мандреном иногда оставляют на месте и вводят маннитол внутривенно капельно (1,0–1,5 г/кг в течение 20–30 мин) и высокие дозы кортикостероидов (10 мг дексаметазона внутривенно струйно), после чего пункционную иглу удаляют.

При полной или частичной блокаде субарахноидального пространства, обусловленной сдавлением спинного мозга, например опухолью, извлечение ЦСЖ может привести к спинальному вклинению с быстрым нарастанием очаговой симптоматики. О наличии спинального блока свидетельствуют результаты ликвородинамических проб, ксантохромия в ЦСЖ (за счет повышения белка) и низкое давление.

У 10–30 % больных возникает постпункционная головная боль, связанная с длительным истечением ЦСЖ через отверстие в твердой мозговой оболочке, приводящим к внутричерепной гипотензии. Боль чаще всего локализуется в лобной и затылочной областях, возникает в первые 3 суток после пункции и обычно продолжается от 2 до 5 дней, но иногда затягивается на несколько недель. Характерно усиление головной боли в вертикальном положении и уменьшение в горизонтальном. Она усиливается при встряхивании головой, сдавлении яремных вен, но уменьшается при сдавлении живота. Боли иногда сопутствуют легкая ригидность шейных мышц, светобоязнь, головокружение. Лечение этого осложнения заключается в соблюдении постельного режима, приеме жидкости, внутривенном или внутримышечном введении 400–600 мг кофеин-бензоната натрия. Постпункционную головную боль можно свести к минимуму, если применять тонкие иглы, вводить иглу параллельно волокнам твердой мозговой оболочки, а перед удалением иглы осторожно повернуть больного на живот. Постельный режим после люмбальной пункции не всегда предотвращает головную боль, однако обычно больным рекомендуют лежать после люмбальной пункции на животе 2–3 часа. У части больных после пункции сохраняется корешковая боль. Изредка отмечается преходящее поражение отводящего нерва с появлением двоения и паралитического сходящегося косоглазия. Возможно развитие менингита, если игла проходит через инфицированные ткани. Крайне редкие осложнения — эпидуральная гематома со сдавлением конского хвоста (обычно у больных с коагулопатией) и холестеатома.

Исследование цереброспинальной жидкости. При получении кровянистой ЦСЖ нужно прежде всего отдифференцировать субарахноидальное кровоизлияние от травматической пункции. Для этого рекомендуют оценить примесь крови в трех последовательно собранных пробирках: в случае «путевой» крови ЦСЖ от первой к третьей пробирке будет постепенно очищаться (соответственно, число эритроцитов от пробирки к пробирке будет уменьшаться), а при внутричерепном кровоизлиянии ЦСЖ во всех трех пробирках будет окрашена одинаково. Но более надежный дифференциальный признак — наличие ксантохромии (результат деградации гемоглобина из распавшихся эритроцитов), которая появляется спустя 2–4 часа от момента кровоизлияния. Следует учитывать, что ксантохромия бывает также результатом гипербилирубинемии или повышенного содержания белка (> 1 г/л). Прозрачность ЦСЖ оценивают, сравнивая ее с водой. При повышенном содержании белка (> 1 г/л) ЦСЖ выглядит желтоватой, а при наличии 200–300 лейкоцитов в 1 мкл становится мутноватой. При метастазах меланомы или желтухе ЦСЖ может быть темной. Клеточный состав ЦСЖ нужно исследовать как можно быстрее (при комнатной температуре лейкоциты быстро распадаются, и уже спустя полчаса их число уменьшится наполовину). При наличии примеси крови исходное число лейкоцитов в ЦСЖ можно рассчитать, исходя из того, что при нормальной картине крови на каждые 700 эритроцитов приходится примерно 1 лейкоцит (при анемии должны быть внесены коррективы).

Увеличение числа клеток в ЦСЖ (плеоцитоз) может происходить за счет нейтрофилов или лимфоцитов. Значительный нейтрофильный плеоцитоз характерен для бактериальной инфекции, лимфоцитарный — для вирусных и хронических воспалительных заболеваний. Однако на ранней стадии развития гнойного менингита цитоз может быть невысоким, с преобладанием лимфоцитов, тогда как при серозном менингите в ЦСЖ могут преобладать нейтрофилы, и лишь повторная люмбальная пункция (через 10–12 часов) позволяет избежать диагностической ошибки. Увеличение числа лейкоцитов отмечается после субарахноидального кровоизлияния и тромбоза венозных синусов. Эозинофилы характерны для паразитарных заболеваний. Многие органические заболевания ЦНС сопровождаются небольшим плеоцитозом. Во всех случаях плеоцитоза, даже если клеточный состав нехарактерен для инфекционного заболевания, необходимо тщательное бактериологическое исследование ЦСЖ. При карциноматозе мозговых оболочек плеоцитоз обычно не превышает 100 клеток в 1 мкл.

Уровень глюкозы в ЦСЖ в норме составляет 50–60 % содержания глюкозы в крови (в норме 2,8–3,9 ммоль/л). При гипергликемии относительно низкий уровень глюкозы (например, при бактериальном менингите) можно принять за нормальный, поэтому, чтобы оценить этот показатель, нужно знать содержание глюкозы в крови. Снижение содержания глюкозы — возможный признак бактериального, туберкулезного, грибкового или канцероматозного менингитов.

Содержание белка в ЦСЖ в норме составляет от 0,2 до 0,45 г/л. В норме около 70 % белка ЦСЖ составляет альбумин и около 12 % — g-глобулины. Белки в ЦСЖ попадают из плазмы путем селективного транспорта или же синтезируются в самом подпаутинном пространстве. Поэтому повышение концентрации белка в ЦСЖ может возникать как в результате общего нарушения иммунологического статуса в организме, так и в результате нарушения гематоэнцефалического барьера, замедленной реабсорбции или повышенного локального синтеза иммуноглобулинов (Ig). Содержание белка нарастает при менингитах и энцефалитах, нейросифилисе, карциноматозе и некоторых других формах опухолей головного мозга. При опухолях спинного мозга или блокаде субарахноидального пространства содержания белка может повышаться в 10–20 раз. Значительное увеличение уровня белка отмечается при синдроме Гийена — Барре (начиная со 2-й недели заболевания), хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии. При наличии примеси крови в ликворе исходное содержание белка можно рассчитать, учитывая,  что при прибавлении 700 эритроцитов уровень белка повышается на 0,1 г/л. Повышение Ig может наблюдаться и при нормальном содержании общего белка в ЦСЖ. Так, повышение Ig обнаруживается при рассеянном склерозе, синдроме Гийена — Барре, нейросифилисе. Скорость синтеза Ig в подпаутинном пространстве может быть выражена ликворным индексом IgG. Он определятся как соотношение IgG в ликворе/в сыворотке. В норме ликворный индекс колеблется от 0 до 0,7. Этот индекс у 70 % больных с клинически достоверным рассеянным склерозом превышает 0,7. Обнаружение олигоклональных IgG методом изоэлектрического фокусирования ликвора также весьма существенно для диагностики рассеянного склероза. Однако выявление олигоклональных групп IgG не является специфичным только для рассеянного склероза. Они выявляются при других заболеваниях ЦНС воспалительной и инфекционной природы. Показатели ЦСЖ при различных состояниях представлены в табл. 1.

Методы обнаружения возбудителя. Решающую роль в диагностике и лечении инфекционных болезней играет определение возбудителя. Обнаружить возбудитель в организме больного можно путем непосредственной микроскопии, бактериологического посева, биологической пробы на животных, вирусологических, серологических методов исследования и ДНК-диагностики.

Для микроскопии и бактериологических посевов используют кровь, ЦСЖ, мочу, слизь из носа и глотки, кал, различные патологические выделения. Количество выросших колоний при микробиологических исследованиях зависит от числа посеянных микроорганизмов и их жизнеспособности к моменту посева. Это означает, что объем и количество ЦСЖ, направленной на микробиологическое исследование, и быстрота ее доставки непосредственно отражаются на результатах исследования. При подозрении на бактериальную инфекцию производят окрашивание приготовленного мазка по Граму. Для исключения туберкулеза осадок ЦСЖ, полученный при центрифугировании, окрашивают на кислотоустойчивые микроорганизмы. При подозрении на грибковое поражение препарат обрабатывают тушью. Обнаружение возбудителя в ликворе (бактериоскопически или методом посева) является абсолютным доказательством соответствующей инфекционной болезни ЦНС. Следует учесть, что при микроскопии мазка ЦСЖ далеко не всегда можно обнаружить возбудителя, при бактериологических посевах материала необходимо время для получения роста микроорганизмов (не менее 72 часов), а, например, рост микобактерий туберкулеза можно получить в культуре не ранее пятой недели, что затрудняет своевременную диагностику.

Биологическая проба на животных применяется, главным образом, при зоонозах. Кроме того, биологическая проба является единственным достоверным лабораторным подтверждением ботулизма.

Вирусологические методы исследования очень трудоемкие и длительные, что не позволяет широко применять их для диагностики.

Для идентификации вирусов, а также ряда бактерий используют серологические методы, в основе которых лежит прямое взаимодействие специфических антител с антигеном. С помощью антител, содержащихся в диагностических иммунных сыворотках, могут быть идентифицированы самые разнообразные антигены, в том числе и патогенных микроорганизмов. Серологические реакции дают возможность судить не только о динамике накопления антител в процессе заболевания, но и о напряженности иммунитета, возникающего после профилактических прививок.

На практике наиболее широко применяются реакции нейтрализации, связывания комплемента, агглютинации, преципитации, нейтрализации и др.

Однако наиболее точными являются серологические реакции с участием меченых антигенов или антител — метод флюоресцирующих антител (МФА) и иммуноферментного анализа (ИФА) (G.T. Wolker et al., 1995).

Принцип МФА состоит во взаимодействии антигена и антитела, меченного флюорохромом. Последний обладает свойством люминесцировать в потоке ультрафиолетовых лучей и не влияет на специфичность антител. Результаты учитываются фотометрически. МФА является экспресс-методом, который позволяет уже через 2–3 часа установить с достаточной степенью точности этиологический диагноз. Так, при клещевом энцефалите максимальное число положительных результатов МФА определяется в первые 3 дня болезни.

ИФА (в иностранной литературе — ELISA) также основан на использовании меченых антител. Принцип метода состоит в обнаружении антигена, фиксированного на определенном носителе специфическими глобулинами, мечеными ферментами. Фермент выявляется различными субстратами, дающими с ним характерное окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству исследуемого антигена. Результаты могут учитываться как визуально, так и инструментально (фотометрически). К настоящему времени разработаны различные варианты ИФА: прямой, непрямой, конкурентный, одинарный и двойной сэндвич-методы и другие его модификации, что позволяет определять отдельные фракции иммуноглобулинов, в частности IgM. Это особенно важно не только для ранней диагностики ряда инфекционных заболеваний (клещевой энцефалит, болезнь Лайма, гепатиты, герпинфекции и др.), но и для установления сроков заражения (цитомегаловирусная инфекция, токсоплазмоз, гепатиты В, С и др.).

В современной практике успешно применяются методы ДНК-диагностики. Их специфичность достигает 100 %, а чувствительность — 75–98 %. Методы ДНК-диагностики по праву считаются самыми быстрыми, чувствительными и экономичными методами не только диагностики, но и контроля за проводимым лечением. Они позволяют выделить возбудитель при самых низких концентрациях в исследуемом материале, могут использоваться при серонегативных реакциях (например, у больных СПИДом), и результат готов в течение нескольких часов (К.Т. Момыналиев, В.М. Говорун, 2000; A.M. Wang, P.E. Mark, 1990).

К методам ДНК-диагностики относят амплификационные технологии, гибридизацию ДНК, методы ДНК-чипов и оптические сенсоры. Следует отметить, что методы ДНК-диагностики не исключают, а лишь дополняют спектр традиционных методов, используемых в микробиологической и вирусологической диагностике в настоящее время.

Амплификационные технологии. В настоящее время наиболее широко используется полимеразная цепная реакция (ПЦР) как для научных исследований, так и в практическом здравоохранении. В основе метода лежит амплификация (многократное умножение, синтез) специфического для данного вида возбудителя фрагмента ДНК. Синтезируемый в ходе ПЦР продукт можно детектировать различными способами. Одним из самых простых, эффективных и распространенных способов является электрофорез. Существуют и другие методы, позволяющие проанализировать образующийся в результате реакции амплификации продукт. К числу таких методов следует отнести жидкостную хроматографию и масс-спектроскопию.

По существу, специфичность ПЦР определяется праймерами и составляет 96–100 %. Такой высокий показатель обусловлен тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного вида возбудителя фрагмент ДНК. Однако возможен небольшой процент ложноположительных реакций, связанных прежде всего с перекрестно-реагируемыми антигенами, которые могут присутствовать в исследуемом материале, а также техническими погрешностями, ингибиторами реакций и т.д.

К существующим модификациям ПЦР относят:

1. Обратная транскриптаза ПЦР (ОТ-ПЦР). В ряде случаев механизм простой ПЦР не пригоден для идентификации РНК. Вместе с тем хорошо известно, что геномы многих вирусов состоят из молекул РНК, и вследствие этого идентификация РНК-вирусов, таких как ВИЧ, представляется актуальной задачей. ОТ-ПЦР позволяет определять РНК-содержащие вирусы.

2. Мультипраймерная ПЦР осуществляет процесс коамплификации нескольких ДНК-матриц в одной реакционной среде с использованием нескольких пар праймеров, что позволяет проводить скрининг по нескольким инфекционным возбудителям, определять одновременно наличие в биопробе комплекса факторов вирулентности и резистентности к антибактериальным и противовирусным препаратам.

3. Гнездовая ПЦР является одной из наиболее распространенных и высокочувствительных модификаций метода ПЦР. В методе используется две пары праймеров с последовательным определением специфического фрагмента ДНК.

4. Метод in situ (IS-ПЦР) в отличие от обычной ПЦР позволяет не только специфически амплифицировать какую-либо последовательность ДНК, но и локализовать ее внутри клетки. Такая способность метода IS-ПЦР делает его неоценимым как в исследовании латентных вирусных инфекций и экспрессии генов в клетке, так и в оценке эффективности новых лекарственных средств на клеточном и молекулярном уровнях.

Кроме ПЦР, к амплификационным технологиям относят лигазную цепную реакцию, которая широко используется в диагностике туберкулеза и некоторых других инфекционных агентов, содержащих ДНК; амплификацию с вытеснением цепи (SDA), реакции опосредованной амплификации (NASA, NAS, 3SR).

Помимо этих методов, используемых для амплификации ДНК-матрицы, необходимо выделить методы гибридизации ДНК (т.е. взаимодействия комплементарных цепей нуклеиновых кислот). В этих методах используются специфические зонды, которые соединены с субстратом или ферментом. В результате происходит многократное усиление образующегося сигнала, регистрируемого тем или иным способом в ходе определения. К числу таких методик следует отнести метод «разветвленной» ДНК (bDNA), основанный на гибридизации исходной матрицы с разветвленной пробой, содержащей несколько реакционно-способных групп, участвующих в процессе детекции. Кроме того, широко используется для скрининга некоторых инфекционных агентов, таких как вирус папилломы человека, хламидий, ЦМВ, метод иммунологического захвата гибрида ДНК/РНК с последующей иммунохимической детекцией.

Для целей практической ДНК-диагностки, кроме вышеперечисленных методик, применяются также и другие технологии, позволяющие решить проблему установления характерных свойств биообъекта, например, его принадлежность к определенному штамму, наличие факторов вирулентности и т.д. К ним относят ДНК-чипы и оптические биосенсоры. Технология ДНК-чипов основана на гибридизации неизвестной нуклеотидной последовательности с расположенными в определенном порядке известными ДНК-последовательностями, иммобилизованными на поверхности стекла или кремния (ДНК-чип) с последующей детекцией. Однако на сегодняшний день нуклеотидная последовательность большинства геномов не расшифрована. Следовательно, то количество информации о генах индивидуального организма, которое можно заложить в ДНК-чип, ограничено, что, в свою очередь, препятствует более широкому применению методов ДНК-чипов. Оптические биосенсоры основаны на ДНК-чипах, но являются открытыми системами, позволяющими проводить наблюдения в реальном режиме времени, что оставляет исследователям больше возможностей для манипуляций, изучения и анализа интересующих генов.

Для методов ДНК-диагностики, в частности ПЦР, наиболее рациональным и эффективным является их применение для обнаружения микроорганизмов, трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий, а также внутриклеточных паразитов и микроорганизмов, способных длительно персистировать в организме хозяина без клинических симптомов. Особое место в этом ряду занимают микобактерии туберкулеза, некоторые вирусы, а также прионы.