Газета «Новости медицины и фармации» 17(257) 2008

Продолжение. Начало в № 16(255), 2008 г.

Ключевую роль в энергообеспечении клеток играют митохондрии, в которых тиотриазолин активирует процесс НАД⁺Н-реокисления этанола. Очевидно, тиотриазолин при развитии  ишемии, во-первых, способствует утилизации восстановленных пиридиннуклеотидов (НАДН) в малат-аспартатном шунте митохондрий. Во-вторых, активируя окисление НАДН в лактатдегидрогеназной реакции в цитозоле, позитивно влияя на утилизацию восстановленных форм пиридиннуклеотидов, тиотриазолин значительно тормозит пути образования активных форм кислорода и активирует окислительное фосфорилирование с увеличением образования АТФ. Вероятнее всего, защитное действие тиотриазолина в условиях ишемии реализуется посредством активации малат-аспартатного челночного механизма, обеспечивающего протонами электронотранспортную цепь. Компенсаторное наращивание мощности малатного шунта сопровождается торможением образования из углеводов ацетил-КоА (пируватдегидрогеназная реакция), который при ишемии используется для синтеза свободных жирных кислот. Активация малат-аспартатного механизма под действием тиотриазолина способствует не только продукции АТФ, но и торможению патологического синтеза липидов.

В ишемизированных клетках и тканях тиотриазолин существенно тормозит процесс накопления свободных аминокислот, повышает уровень РНК, активирует процессы синтеза протеина, что указывает на инициирование реакций адаптации в клетках, обеспечивающих перестройку метаболизма ткани в условиях гипоксии без повышения потребности в кислороде и образования свободных радикалов.

Таким образом, тиотриазолин в условиях ишемии обеспечивает окислительную продукцию энергии прежде всего за счет активации малат-аспартатного шунта, обеспечивая протонами транспортную цепь, усиливая утилизацию восстановленных пиридиннуклеотидов, тормозя образование АФК в биоэнергетических реакциях, снижая патологический синтез липидов и значительно стимулируя адаптивный синтез протеина.

Антиоксидантное действие тиотриазолина, по мнению ряда исследователей, заключается в том, что препарат активирует антиоксидантные ферменты — супероксиддисмутазу, каталазу, глутатионпероксидазу, способствует более экономному расходованию эндогенного антиоксиданта — α-токоферола, тормозит образование промежуточных и конечных продуктов перекисного окисления липидов — диеновых конъюгат, триенкетонов и малонового диальдегида. В последнее время появились публикации об ингибирующем воздействии тиотриазолина на процессы окислительной модификации белка. Столь высокая антиоксидантная активность препарата, реализуемая на инициальных этапах свободнорадикального окисления, регистрируемая в условиях моделирования различных патологических процессов, позволила сделать предположение о наличии в механизме антиоксидантного действия тиотриазолина способности улавливать АФК. Исследованиями in vitro было показано, что тиотриазолин в диапазоне концентраций 10^–5–10^–7 M снижает концентрацию таких АФК, как супероксид-радикал (О^·–₂) и пероксинитрит (ОNОО^–). Подобное действие тио­триазолин проявляет благодаря тому, что в его структуре содержится тиольная группа, придающая всей молекуле высокие восстановительные свойства и способная принимать от АФК электроны. В результате сера в тиольной группе переходит из двух- в четырехвалентное состояние. Тиотриазолин не только улавливает АФК благодаря сильным восстановительным свойствам тиольной группы, но и тормозит основные пути их образования.

Прежде всего тиотриазолин уменьшает образование АФК в митохондриях за счет утилизации восстановленных форм пиридиннуклеотидов и сохранения окислительной продукции энергии, а также в ксантиноксидазной реакции как за счет нормализации обмена адениловых нуклеотидов, так и за счет торможения превращения ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу под действием окислительного воздействия АФК. Тиотриазолин ограничивает выработку АФК в митохондриях, по всей видимости, за счет прямого ингибирующего действия на НАДН-оксидазные системы митохондрий, что подтверждается нашими работами in vitro; уменьшает активирующее воздействие метаболического ацидоза на АФК-образующие системы. Тиотриазолин, снижая гиперпродукцию супероксид-радикала и пероксинитрита, предупреждает окислительную модификацию белковых структур рецепторов, ионных каналов, ферментов, факторов транскрипции и т.д. Наиболее изучено протективное действие тиотриазолина в отношении сульфгидрильных групп цистеиновых и метиониновых фрагментов белковых молекул. Тиотриазолин конкурирует с этими структурами за супероксид-радикал, в результате чего предотвращает как обратимую, так и необратимую их модификацию. В результате ингибирования обратимой модификации предотвращается образование -S-S-связи в цистеиновых участках Na⁺/К⁺-АТФазы, уменьшается потеря чувствительности фермента к регулирующему действию АТФ. Снижение образования -S-S-cвязей в молекуле ксантиндегидрогеназы под действием тиотриазолина предупреждает ее превращение в ксантиноксидазу и препятствует образованию АФК.

Более значимое по эффективности действие тиотриазолина реализуется в отношении необратимой модификации сульфгидрильных групп ряда белковых молекул под действием АФК. Так, тиотриазолин тормозит образование в белках необратимых сульфоксидов и сульфоновых групп, которые в дальнейшем легко подвергаются окислению. Оказывая тормозящее воздействие на необратимую окислительную модификацию сульфгидрильных групп цистеиновых фрагментов белковых молекул, тиотриазолин нормализует сдвиги redoxi-регуляции в условиях оксидативного стресса. Прежде всего тиотриазолин предупреждает развитие нарушения равновесия тиосульфидной системы при гиперпродукции АФК, обеспечивая такие функции, как передача клеточного сигнала через рецепторно-ионноформный комплекс, сохраняя активность белков, ферментов, факторов транскрипции и целостность клеточных мембран. Опытами in vitro при моделировании оксидативного и нитрозирующего стресса реактивом Фентона и избытком нитропруссида было установлено, что тиотриазолин в концентрациях 10^–5–10^–7 М препятствует окислению цистеина и образованию цистеинсульфоксида, а также тормозит образование нитротирозина. Исходя из этого можно полагать, что тиотриазолин препятствует необратимой инактивации фактора транскрипции NF-kappa В, защищая от избытка АФК чувствительные остатки цистеина — Cys 252, Cys 154 и Cys 61 в его ДНК-связывающих доменах. Кроме того, тиотриазолин может участвовать в восстановлении этих групп при обратимой инактивации, принимая на себя роль Redox Faktor-1.

Тормозя окислительную инактивацию фактора транскрипции NF-kappa В при избытке АФК, тиотриазолин, возможно, усиливает активацию экспрессии Redox-чувствительных генов, которые необходимы для защиты клеток от токсических эффектов оксидативного стресса. Среди этих генов есть гены, ответственные за синтез супероксиддисмутазы. Подобное утверждение нашло отражение в работах, в которых убедительно показано влияние тиотриазолина на повышение активности супероксиддисмутазы в условиях ишемии и других экстремальных состояний организма. Другим механизмом повышения активности этого фермента может быть прямая защита тиотриазолином металлопротеинового комплекса СОД, содержащего медь, цинк или марганец, от избытка пероксинитрита.

В последнее время было установлено, что тиотриазолин обладает антиапоптозным действием. Нами было выдвинуто предположение о тесной взаимосвязи подобного эффекта с антиоксидантным действием препарата. По всей видимости, способность тиотриазолина сохранять тиосульфидное равновесие посредством как прямой конкуренции с сульфгидрильными соединениями за супероксид-радикал и пероксинитрит, так и активирующего воздействия на систему «глутатионпероксидаза — глутатионредуктаза», описанного в наших ранних работах, способствует сохранению равновесия пары «тиоредоксин окисленный — тио­редоксин восстановленный» в условиях избытка АФК. Тиотриазолин, уменьшая накопление избыточного количества окисленого тиоредоксина, возможно, тормозит МАР-киназный каскад проапоптозной системы JNK, снижая тем самым инициирование апоптоза.

Одной из важных составляющих фармакологической характеристики тиотриазолина, послужившей обоснованием для участия этого препарата в качестве действующего компонента в составе Тиодарона, является его антитоксическая и гепатопротективная активность. И это не случайно. Основной проблемой применения амиодарона является высокая токсичность препарата, вызывающая необходимость его отмены. В Украине частота побочных эффектов амиодарона, вызвавших его отмену, составила 4,9 %. Амиодарон подавляет метаболизм жирных кислот в гепатоцитах, вызывает стеатоз печени. Кроме того, амиодарон нарушает перенос электронов в дыхательной цепи, способствует открытию циклоспорин-А-зависимой поры митохондрий гепатоцитов и активации паразитарных реакций, в которых образуется большое количество АФК, инициирующих развитие оксидативного стресса. При назначении амиодарона наблюдается значительное повышение маркеров окислительной модификации белка — карбоксилированных белковых  продуктов, маркеров пероксидации жирных кислот — п-алкеналей, 2-алкеналей, 2,4-алкандиенов, алкантриенов, α-гидрокиалкеналей, гид­ропероксиалкенов и малонового диальдегида и угнетение активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы. Подобные изменения приводят к развитию стеатогепатита. Снижается количество восстановленных тиолов. Применение амиодарона способствует формированию митохондриальной дисфункции с выраженным энергодефицитом, экспрессии про­апоптических факторов и инициации апоптоза.

При просмотре гистологических срезов печени животных, длительно принимавших амиодарон, наблюдались признаки токсического гепатита. На срезах, окрашенных суданом, было видно, что цитоплазма гепатоцитов заполнена мелкими и крупными каплями жира, что свидетельствует о жировой дистрофии печени. Жировая  дистрофия печени носила диффузный характер. На срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, наблюдались вакуолизация цитоплазмы гепатоцитов, набухание клеточных тел, нечеткость клеточных границ и бледная окраска некоторых групп ядер. Экспериментальные исследования гепатопротективного действия тиотриазолина показали, что его назначение животным с лекарственным гепатитом приводило к снижению активности трансаминаз, щелочной и кислой фосфатазы, уровней билирубина и холестерина. Назначение тиотриазолина приводило к повышению уровня восстановленного глутатиона и цитохрома Р₄₅₀, а также значительно улучшало морфологическую картину печени. Так, исследование метаболической функции печени показало, что у животных, получавших тиотриазолин, оказалось большее содержание гликогена по сравнению с животными, не получавшими ­препарат. 

Исследование пролиферативной и репаративной функции паренхимы печени показало, что у животных, получавших тиотриазолин, на фоне лекарственного гепатита часто встречались двухъядерные гепатоциты, которые либо осуществляли амитотическое деление, либо завершали его. Двухъ­ядерность гепатоцитов, как принято считать, является своеобразным механизмом приспособления для увеличения поверхностных отношений между ядром и цитоплазмой, особенно при повышенной нагрузке на орган, например при осуществлении репаративных процессов в поврежденной печени.

Наиболее удачным примером, показывающим перспективность использования тиотриазолина в качестве активно действующего компонента в комбинированном препарате Тиодарон, стало экспериментальное исследование кардиопротективных свойств тиотриазолина при моделировании ишемии миокарда (многократное введение коронароспастического агента) у лабораторных животных (крысы линии Вистар). Так, экспериментальная терапия миокардиальной ишемии тиотриазолином (50 мг/кг) приводила к некоторому снижению ЧСС, уменьшению отклонения ST, способствовала восстановлению до контрольного уровня амплитуды зубца Т, что свидетельствовало о противоишемическом действии препарата (табл. 2).

Ишемическое повреждение миокарда приводило к уменьшению плотности ядер кардиомиоцитов, снижению в них концентрации РНК при снижении концентрации РНК в цитоплазме кардиомиоцитов по сравнению с интактными животными, повышению количества апоптически измененных кардиомиоцитов. Указанные изменения свидетельствовали об ишемических нарушениях метаболизма кардиомиоцитов, в частности о нарушении баланса процессов биосинтеза в миокарде, деструкции клеток и усилении апоптоза. Экспериментальная терапия тиотриазолином приводила к увеличению концентрации РНК в ядрах и цитоплазме кардиомиоцитов по сравнению с нелеченными животными. Вместе с тем подобное влияние тиотриазолина на ишемизированный мио­кард сочеталось с увеличением плотности и площади ядер кардиомиоцитов по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о стимуляции процессов транскрипции и противоишемических и репаративных свойствах тиотриазолина. Введение тиотриазолина приводило и к уменьшению апоптически измененных кардиомиоцитов, что свидетельствовало и об антиапоптическом действии препарата (табл. 3).

Многократное введение животным коронароспастического агента приводило к угнетению процессов синтеза оксида азота, выполняющего в условиях ишемии миокарда роль эндотелиопротективного и кардиопротективного фактора, о чем свидетельствовало уменьшение активности NO-синтазы, снижение продукции стабильных метаболитов оксида азота — нитратов на фоне выраженного дефицита субстрата синтеза — L-аргинина. Параллельно регистрировалось и нарушение транспорта оксида азота — снижение уровня тиосодержащих аминокислот и суммарного количества восстановленных тиолов белковых молекул. Общеизвестно, что NO является нестабильным, короткоживущим радикалом и для его стабилизации и последующей транспортировки предусмотрены такие механизмы, как образование с тиосодержащими низкомолекулярными соединениями (глутатион, цистеин, метионин) устойчивых тионитрозольных комплексов. В условиях дефицита тиольных соединений (оксидативный стресс, ишемия, интоксикации, печеночная недостаточность и т.д.) нарушается транспорт NO, т.к. он подвергается атаке таких АФК, как супероксид-радикал и гидроксил-радикал, с превращением в цитотоксический продукт – пероксинитрит. При этом наблюдается усиление ишемического повреждения кардиомиоцитов, интенсификация оксидативного и нитрозирующего стресса. Уровень тиолов регулируется таким ферментом, как глутатионредуктаза. Тиотриазолин не оказывает прямого стимулирующего действия на активность NO-синтазы и уровень L-аргинина, т.е. не влияет на продукцию оксида азота в условиях ишемии. Но тиотриазолин обладает уникальными свойствами оказывать защитное действие в отношении транспорта NO за счет сохранения восстановленных тиолов. Так, было установлено, что введение тиотриазолина повышает уровень восстановленных тиольных групп как за счет прямого антиоксидантного действия молекулы тиотриазолина, так и за счет повышения активности глутатионредуктазы. Кроме того, мы предполагаем, что тиотриазолин сам может являться переносчиком NO, образуя с ним стабильные тионитрозильные комплексы; тиотриазолин тем самым предотвращает превращение NO под действием АФК в пероксинитрит (о чем свидетельствовало снижение нитротирозина), сохраняя его эндотелиопротективные свойства.

Моделирование ишемии миокарда приводило к типичным ишемическим нарушениям энергетического метаболизма миокарда — активации гликолиза, дискоординации в цикле Кребса, истощению углеводных резервов, торможению компенсаторных шунтов энергии. Назначение тиотриазолина приводило к усилению продукции АТФ за счет интенсификации аэробных процессов. При этом тиотриазолин не влиял на истощение субстратов окисления — гликогена и глюкозо-6-фосфата. Тиотриазолин уменьшал активность малопроизводительного анаэробного гликолиза, о чем свидетельствовало снижение уровня лактата, нормализовывал окисление в цикле Кребса на дикарбоновом (повышение уровня малата) и особенно трикарбоновом (повышение уровня изоцитрата) участках и дыхательной цепи (активность цитохром-С-оксидазы). Немаловажным моментом в механизме энерготропного действия тиотриазолина было его активирующее влияние на компенсаторный малат-аспартатный шунт. Малат-аспартатный челнок осуществляет перенос восстановленных эквивалентов, образующихся в цитоплазме в ходе гликолиза, в митохондрии в условиях ишемии. Образующийся в цитоплазме в условиях пониженного содержания кислорода НАДН⁺ используется для превращения щавелевоуксусной кислоты в малат, и этот малат проникает в митохондрию и участвует в экспорте α-кетоглутарата. Этот малат в митохондриях превращается в щавелевоуксусную кислоту с образованием НАДН, доступного для электронотранспортной цепи (из 2 протонов образуются 3 молекулы АТФ). Образовавшаяся из малата щавелевоуксусная кислота превращается в α-кетоглутарат и аспартат. α-кетоглутарат идет из митохондрий в обмен на малат, а аспартат обменивается на глутамат. Перенос происходит за счет градиента глутамата и высокого внутримитохондриального отношения глутамат/аспартат. Соотношение НАДН/НАД⁺ и малат/щавелевоуксусная кислота регулируется малатдегидрогеназой (МДГ). При моделировании стенокардии наблюдалось торможение малат-аспартатного шунта, что выражалось в снижении активности МДГ, уменьшении уровня малата, аспартата и глутамата. Тиотриазолин уменьшал торможение активности малат-аспартатного шунта, о чем свидетельствовало повышение активности МДГ, увеличение содержания малата, аспартата и глутамата. Тиотриазолин увеличивал не только продукцию энергии, но и ее транспорт, о чем свидетельствовало увеличение активности митохoндриальной (КФК_мх) и цитоплазматической креатинфосфокиназы (КФК_цт). Биохимическими исследованиями сыворотки крови было выявлено уменьшение гиперферментемии сердечного изоэнзима креатинфосфокиназы (МВ-КФК), что подтверждало противоишемическое действие тиотриазолина.

Общеизвестно, что ишемия сопровождается угнетением антиоксидантной системы и развитием оксидативного стресса. При моделировании стенокардии наблюдалось угнетение активности СОД и повышение уровня маркеров окислительной модификации белка АФГ и КФГ в миокарде. Введение тиотриазолина оказывало значительный антиоксидантный эффект, что проявлялось в повышении активности СОД и снижении маркерных продуктов — АФГ и КФГ. Ишемические изменения обмена белка в миокарде характеризовались снижением количества цитоплазматического и митохондриального белка, уменьшением коэффициента «белок/мочевина» и особенно коэффициента «белок/свободные аминокислоты». Эти данные согласуются с данными морфометрических исследований и свидетельствуют об угнетении процесса синтеза белка. Введение тиотриазолина животным со стенокардией стимулировало процессы адаптивного синтеза протеина и свидетельствовало о наличии у тиотриазолина репаративных свойств, что подтверждается и приведенными выше результатами морфометрии. Полученные нами результаты свидетельствуют о наличии у тиотриазолина кардиопротективных, противоишемических, антиоксидантных, антиапоптических, гепатопротективных свойств и являются экспериментальным обоснованием создания комбинированного антиангинального препарата амиодарона и тиотриазолина — Тиодарона. Учитывая приведенные данные о молекулярно-биохимических механизмах кардио­протективного действия тиотриазолина, а также роль АФК и цитотоксических интермедиатов NO, дискоординацию митохондриальных энергопродуцирующих реакций в формировании эндотелиальной дисфункции и миокардиальной ишемии, целесообразным является дальнейшее углубленное изучение фармакологических свойств Тиодарона.

Несмотря на постоянные усилия по оптимизации лечения заболеваний сердца, проблема остается нерешенной. С учетом растущей стоимости медицинской помощи, сопутствующих социальных проблем актуальны разработка и внедрение новых подходов, методов, схем терапии, способствующих реальному повышению клинической эффективности проводимой терапии. Важным элементом решения данной комплексной проблемы является создание новых высокоэффективных и безопасных лекарственных препаратов, применение которых приводило бы к улучшению качества и увеличению продолжительности жизни, а также к уменьшению осложнений. В связи с этим своевременным стало создание комбинированного антиангинального и антиаритмического препарата Тиодарон.